华宝效应的起源和终结 Origin and Termination of Warburg Effect

　

华宝效应的起源和终结 Origin and Termination of Warburg Effct

　

沃堡效应的起源
项目总结：
真核细胞具有两种能量（ATP）产生机制：线粒体呼吸和糖酵解发酵。通过路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）的开创性研究，人们认为只有在氧气不足以支持呼吸的情况下，发酵效率才会降低。直到大约100年前这仍然是主流的思想，当时获得诺贝尔奖的德国内科医生奥托·沃伯格（Otto Warburg）表明，即使存在充足的氧气和足够的线粒体功能，癌细胞也可以高速率发酵葡萄糖（1）。从那以后，癌细胞选择使用效率较低的发酵途径而不是效率较高的呼吸的原因一直是个谜。

我们相信，我们已经解决了这个谜团，只需要说服他人。我们认为，由于效率差异很大，因此这与大多数人致力于研究的能源生产无关。相反，我们认为，这必须与发酵副产物的产生有关（2）。我们认为该副产物是乳酸，并通过实验表明：1）产酸与癌症侵袭增加相关（3、4），2）中和酸可以防止侵袭（5-10）和3）刺激产酸可以促进入侵（罗素，准备中）。因此，A）发酵产生酸，B）酸产生改善了这样做的癌细胞的适应性和存活率，C）发酵的癌症更有可能成功，并且在我们检测到的癌症中占主导地位（11-14）。

　

The HIF-1 pathway. Oxygen-sensing prolyl hydroxylase domain enzymes (PHDs) target hypoxia-inducible factor (HIF)-α subunits for proteasomal degradation in normoxia through hydroxylation.

The HIF-1 pathway. In normoxia, the oxygen-sensing hydroxylases PHD1, PHD2, PHD3 and FIH hydroxylate HIF-1 α at proline 402 and 564 and at asparagine 803. The prolyl hydroxylations (shown in green) lead to poly-ubiquitination and degradation of HIF-1 α , while the asparaginyl hydroxylation (shown in red) blocks the recruitment of the co-activators p300 and CBP [CREB (cAMP-response-element-binding protein)-binding protein], inhibiting the transactivation function of HIF-1 α. In hypoxia the hydroxylases are inhibited, HIF-1 α escapes the hydroxylations and therefore its degradation and inactivation, translocates into the nucleus, and switches on gene expression.

　

Similar to collagen prolyl-4-hydroxylase ([C-P4H]; EC 1.14.11.2), PHDs require molecular oxygen and 2-oxoglutarate as cosubstrates, as well as ferrous iron and probably l-ascorbic acid (vitamin C) as cofactors for enzymatic activity. 13 K m values of PHDs for oxygen are strikingly higher than those of other prolyl-4-hydroxylases. 13 The relatively low oxygen affinity is essential for effective oxygen …

https://www.researchgate.net/figure/The-HIF-1-pathway-In-normoxia-the-oxygen-sensing-hydroxylases-PHD1-PHD2-PHD3-and-FIH_fig3_235383479

　

　

F1: (A) Oxygen-dependent regulation of HIF-1α targets in epithelial restitution. Under normal oxygen tensions (normoxia) (i) prolyl hydroxylase (PHD) enzymes hydroxylate the HIF-1α subunit resident in the cellular cytoplasm (26). Hydroxylated HIF-1α facilitates, (ii) the binding of von Hippel–Lindau protein (pVHL) and subsequent recruitment of the ubiquitin ligase complex, (iii) targeting HIF-1α for 26S proteasomal degradation (28). Under conditions of reduced oxygen (hypoxia) (iv) the lack of oxygen substrate for PHD prevents hydroxylation of HIF-1α leading to (v) cytoplasmic accumulation and translocation to the cell nucleus (29). (vi) HIF-1α dimerizes with HIF-1β and binds to hypoxia responsive elements (5′-ACGTGC-3′) in the promoter of target genes (21, 30). (vii) This leads to transcription of HIF target genes involved in epithelial restitution. (B) As tissue oxygen levels gradually decline, HIF stabilization increases. This results in graded HIF stabilization during progressive hypoxia (31), such as the progression of inflammation.

https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC3769679_fimmu-04-00272-g001&req=4

　

Von Hippel Lindau Protein - an overview | ScienceDirect Topics
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and...

Von Hippel Lindau Protein. VHL protein (pVHL) encoded by the Vhl gene was further revealed as a component of a ubiquitin ligase complex (Maxwell et al., 1999) required for the specific degradation of hypoxia-inducible factor (HIF) discovered at the same period (Semenza and Wang, 1992).

　

PHD2 in tumour angiogenesis
D A Chan & A J Giaccia
British Journal of Cancer volume 103, pages1–5(2010)Cite this article

Originally identified as the enzymes responsible for catalysing the oxidation of specific, conserved proline residues within hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), the additional roles for the prolyl hydroxylase domain (PHD) proteins have remained elusive. Of the four identified PHD enzymes, PHD2 is considered to be the key oxygen sensor, as knockdown of PHD2 results in elevated HIF protein. Several recent studies have highlighted the importance of PHD2 in tumourigenesis. However, there is conflicting evidence as to the exact role of PHD2 in tumour angiogenesis. The divergence seems to be because of the contribution of stromal-derived PHD2, and in particular the involvement of endothelial cells, vs tumour-derived PHD2.

PHD2 in tumour angiogenesis | British Journal of Cancer
https://www.nature.com/articles/6605682

　

RED CELLS, IRON, AND ERYTHROPOIESIS| MAY 19, 2011
Vitamin C is dispensable for oxygen sensing in vivo

Abstract
Prolyl-4-hydroxylation is necessary for proper structural assembly of collagens and oxygen-dependent protein stability of hypoxia-inducible transcription factors (HIFs). In vitro function of HIF prolyl-4-hydroxylase domain (PHD) enzymes requires oxygen and 2-oxoglutarate as cosubstrates with iron(II) and vitamin C serving as cofactors. Although vitamin C deficiency is known to cause the collagen-disassembly disease scurvy, it is unclear whether cellular oxygen sensing is similarly affected. Here, we report that vitamin C–deprived Gulo−/− knockout mice show normal HIF-dependent gene expression. The systemic response of Gulo−/− animals to inspiratory hypoxia, as measured by plasma erythropoietin levels, was similar to that of animals supplemented with vitamin C. Hypoxic HIF induction was also essentially normal under serum- and vitamin C–free cell-culture conditions, suggesting that vitamin C is not required for oxygen sensing in vivo. Glutathione was found to fully substitute for vitamin C requirement of all 3 PHD isoforms in vitro. Consistently, glutathione also reduced HIF-1α protein levels, transactivation activity, and endogenous target gene expression in cells exposed to CoCl2. A Cys201Ser mutation in PHD2 increased basal hydroxylation rates and conferred resistance to oxidative damage in vitro, suggesting that this surface-accessible PHD2 cysteine residue is a target of antioxidative protection by vitamin C and glutathione.

Topics:ascorbic acid, enzymes, hydroxylation, hypoxia, oxygen, cell culture techniques, cysteine, protein isoforms, alpha ketoglutarate, iron
Vitamin C is dispensable for oxygen sensing in vivo ...
https://ashpublications.org/blood/article/117/20/...

Emerging novel functions of the oxygen-sensing prolyl hydroxylase domain enzymes

Oxygen-sensing prolyl hydroxylase domain enzymes (PHDs) target hypoxia-inducible factor (HIF)-α subunits for proteasomal degradation in normoxia through hydroxylation. Recently, novel mechanisms of PHD activation and function have been unveiled. Interestingly, PHD3 can unexpectedly amplify HIF signaling through hydroxylation of the glycolytic enzyme pyruvate kinase (PK) muscle isoform 2 (PKM2). Recent studies have also yielded insight into HIF-independent PHD functions, including the control of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor trafficking in synaptic transmission and the activation of transient receptor potential cation channel member A1 (TRPA1) ion channels by oxygen levels in sensory nerves. Finally, PHD activation has been shown to involve the iron chaperoning function of poly(rC) binding protein (PCBP)1 and the ( R)-enantiomer of 2-hydroxyglutarate (2-HG). The intersection of these regulatory pathways and interactions highlight the complexity of PHD regulation and function.

Emerging novel functions of the oxygen-sensing prolyl hydroxylase domain enzymes: Trends in Biochemical Sciences
https://www.cell.com/trends/biochemical-sciences/fulltext/S0968-0004(12)00159-4

　

华宝效应的起源和终结 Origin and Termination of Warburg Effct

　

沃堡效应的起源
项目总结：
真核细胞具有两种能量（ATP）产生机制：线粒体呼吸和糖酵解发酵。通过路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）的开创性研究，人们认为只有在氧气不足以支持呼吸的情况下，发酵效率才会降低。直到大约100年前这仍然是主流的思想，当时获得诺贝尔奖的德国内科医生奥托·沃伯格（Otto Warburg）表明，即使存在充足的氧气和足够的线粒体功能，癌细胞也可以高速率发酵葡萄糖（1）。从那以后，癌细胞选择使用效率较低的发酵途径而不是效率较高的呼吸的原因一直是个谜。

我们相信，我们已经解决了这个谜团，只需要说服他人。我们认为，由于效率差异很大，因此这与大多数人致力于研究的能源生产无关。相反，我们认为，这必须与发酵副产物的产生有关（2）。我们认为该副产物是乳酸，并通过实验表明：1）产酸与癌症侵袭增加相关（3、4），2）中和酸可以防止侵袭（5-10）和3）刺激产酸可以促进入侵（罗素，准备中）。因此，A）发酵产生酸，B）酸产生改善了这样做的癌细胞的适应性和存活率，C）发酵的癌症更有可能成功，并且在我们检测到的癌症中占主导地位（11-14）。
　

Origin of the Warburg Effect
Project Summary:
Eukaryotic cells have two mechanisms of energy (ATP) production: mitochondrial respiration and glycolytic fermentation. Through the groundbreaking work of Louis Pasteur, it was thought that the less efficient fermentation would ensue only if there was insufficient oxygen to support respiration. This was the predominant thought until about 100 years ago, when the Nobel Prize-winning German Physician, Otto Warburg showed that cancer cells ferment glucose at a high rate, even in the presence of adequate oxygen and sufficient mitochondrial function (1). The reasons that cancer cells choose to use the less efficient fermentative pathway over the more efficient respiration have remained a mystery ever since. We believe that we have solved this mystery, and only need to convince others. We have argued that as the efficiencies are so different, this has nothing to do with energy production, where most have been focusing their time. Instead, we argue, that it must have to do with the production of a by-product of fermentation (2). We believe that this byproduct is lactic acid, and have shown through experiments that: 1) acid production is associated with increased cancer invasion (3, 4), 2) that neutralization of acid can prevent invasion (5-10), and 3) that stimulation of acid production can promote invasion (Russell, in prep). Hence, A) fermentation produces acid, B) acid production improves the fitness and survival of cancer cells that do this, and C) cancers that ferment are more likely to succeed and be predominant in those that we detect (11-14).

https://lab.moffitt.org/gillies/research/tumor-ph/origin-of-the-warburg-effect/

A unifying theory of carcinogenesis, and why targeted therapy doesn’t work - ScienceDirect
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0720048X12700189

A unifying theory of carcinogenesis, and why targeted therapy doesn't work. - PubMed - NCBI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23083599

References:

Warburg O, Posener K. Uber den stoffwechsel der carcinomzelle. Bioichem Z 1924;152:309-44.
Gillies RJ, Robey I, Gatenby RA. Causes and consequences of increased glucose metabolism of cancers. J Nucl Med 2008;49 Suppl 2:24S-42S.
Estrella V, Chen T, Lloyd M, Wojtkowiak J, Cornnell HH, Ibrahim-Hashim A, et al. Acidity generated by the tumor microenvironment drives local invasion. Cancer research 2013;73(5):1524-35.
Gatenby RA, Gawlinski ET, Gmitro AF, Kaylor B, Gillies RJ. Acid-mediated tumor invasion: a multidisciplinary study. Cancer research 2006;66(10):5216-23.
Ibrahim Hashim A, Cornnell HH, Coelho Ribeiro Mde L, Abrahams D, Cunningham J, Lloyd M, et al. Reduction of metastasis using a non-volatile buffer. Clin Exp Metastasis 2011;28(8):841-9.
Ibrahim-Hashim A, Abrahams D, Enriquez-Navas PM, Luddy K, Gatenby RA, Gillies RJ. Tris-base buffer: a promising new inhibitor for cancer progression and metastasis. Cancer Med 2017.
Ibrahim-Hashim A, Cornnell HH, Abrahams D, Lloyd M, Bui M, Gillies RJ, et al. Systemic buffers inhibit carcinogenesis in TRAMP mice. J Urol 2012;188(2):624-31.
Ibrahim-Hashim A, Robertson-Tessi M, Enriquez-Navas PM, Damaghi M, Balagurunathan Y, Wojtkowiak JW, et al. Defining Cancer Subpopulations by Adaptive Strategies Rather Than Molecular Properties Provides Novel Insights into Intratumoral Evolution. Cancer research 2017;77(9):2242-54.
Ribeiro MD, Silva AS, Bailey KM, Kumar NB, Sellers TA, Gatenby RA, et al. Buffer Therapy for Cancer. Journal of nutrition & food sciences 2012;2:6.
Robey IF, Baggett BK, Kirkpatrick ND, Roe DJ, Dosescu J, Sloane BF, et al. Bicarbonate increases tumor pH and inhibits spontaneous metastases. Cancer research 2009;69(6):2260-8.
Gatenby RA, Gillies RJ. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat Rev Cancer 2004;4(11):891-9.
Gatenby RA, Gillies RJ. A microenvironmental model of carcinogenesis. Nat Rev Cancer 2008;8(1):56-61.
Gatenby RA, Gillies RJ, Brown JS. Evolutionary dynamics of cancer prevention. Nat Rev Cancer 2010;10(8):526-7.
Gillies RJ, Verduzco D, Gatenby RA. Evolutionary dynamics of carcinogenesis and why targeted therapy does not work. Nat Rev Cancer 2012;12(7):487-93.

　

通过自适应策略而非分子性质定义癌症亚群，为肿瘤内进化提供了新的见解

持续的肿瘤内进化（intrarumoral evolution)在同一肿瘤不同区域的癌细胞之间的分子变异中很明显，但是仅靠遗传数据就无法了解环境选择力(environmental selective force)和控制潜在的达尔文动力学(Darwinian dynamics)的细胞表型适应性。在三种自发的鼠类癌症（TRAMP和PTEN小鼠的前列腺癌，KPC小鼠的胰腺癌）中，我们鉴定了两个亚群，它们具有独特的生态环境构建适应性策略（niche construction adaptive strategies)，可在培养物中保持稳定：（i）通过上调有氧糖酵解增加产酸的侵袭性细胞（ii）血管生成和代谢接近正常的非侵入性细胞。

在TRAMP前列腺癌中研究了这些亚群的达尔文相互作用(Darwinian interactions)。计算机模拟表明，侵入性产酸（C2）细胞通过促进侵入并降低免疫反应的功效，相对于非侵入性血管生成（C3）细胞保持了体能优势。未经治疗的肿瘤的免疫组织化学分析证实，C2细胞总是比C3细胞丰富。然而，由于能量生产效率低（即有氧糖酵解）和用于适应酸性环境的资源枯竭，C2适应性策略表型产生了可观的成本。数学模型仿真预测，微环境细胞外pH（pHe）的小扰动可能会反转C2策略的成本/收益比，并选择C3细胞。在体内，向4周大的TRAMP小鼠的饮用水中添加200 mmol / L NaHCO3可将前列腺内pHe增加0.2个单位，并促进非侵入性C3细胞的增殖，后者仍被限制在导管内，因此不会发生原发性癌症。在已建立的肿瘤中，0.2 pHe的增加会增加C3细胞的比例，并显着减少原发性和转移性肿瘤的生长。在实验性的肿瘤构建物中，将MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞共注入SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。 C2样MDA-MB-231细胞在未经治疗的动物中占主导地位，但当肿瘤内pHe增加时，选择了C3样MCF7细胞并且肿瘤生长减慢。总体而言，我们的数据支持对环境选择力和癌细胞适应策略的肿瘤内达尔文相互作用的数学建模。这些模型允许通过施加较小但选择性的生物力将肿瘤引导至侵入性较小的途径。癌症研究； 77（9）; 2242–54。 ©2017 AACR。

主要发现
通过其适应性策略而不是分支克隆进化模型中使用的分子特性来定义肿瘤内亚群，可以数学方式识别和构筑细胞和环境的相互作用。在充分了解潜在的生态进化力的情况下，可以利用复杂的动态系统放大小扰动的趋势，通过应用相对较小的生物扰动将肿瘤引导至非侵入性生长机制。

　

A，顶部图像是在不同处理下每种细胞系和混合物（MDA-MB-231和MCF7，1：1）的代表性肿瘤的H＆E图像。下图是与H＆E中相同肿瘤的连续切片的ER染色。 B，在该实验中使用的所有肿瘤中ER表达的分析。请注意，用碳酸氢盐400 mmol / L处理的那些肿瘤（由MDA-MB-231和MCF7的混合物（1：1组成））中的ER表达要比自来水中的更大（P = 0.0001）。 C，该实验中使用的所有肿瘤的MRI体积数据。数据表示为肿瘤体积相对于肿瘤注射后天数的变化倍数。显示了平均值±SEM。使用两尾学生t检验来计算统计学显着性。

　

生态位建设进化策略操纵模型。我们的假设是，肿瘤由两个不同的细胞亚群组成：高度糖酵解的产酸细胞（红细胞）和非糖酵解的非产酸细胞（蓝细胞）。我们的模型预测，pHe的微小扰动可能会诱导种群相变，从而有利于非产酸，非侵袭性癌症亚群。 PIN，前列腺上皮内瘤变。

Model for manipulation of niche construction evolutionary strategy. Our hypotheses is that tumors consist of two distinct subpopulations of cells, highly glycolytic, acid-producing cells (red cells), and nonglycolytic, non–acid-producing cells (blue cells). Our model predicts that small perturbations in pHe could induce a population phase transition favoring the non–acid-producing, noninvasive cancer populations. PIN, prostate intraepithelial neoplasia.

　

介绍
近期的一些研究表明，人类癌症的不断发展导致人类遗传学上多个遗传上不同的种群（1、2）。但是，我们注意到，仅遗传学特征就无法提供对环境选择压力和细胞适应策略的深入了解，而后者是控制达尔文动力学的逻辑原因→效应联系（3）。在这里，我们将瘤内进化作为亚群之间的动态相互作用，而不是由其分子特性决定，而是通过适应策略以及这些策略与微环境特性的相互作用来定义。

我们解决三个一般性问题：（i）我们可以定义不同癌症之间常见的适应性策略吗？（ii）支配亚群间肿瘤内竞争的进化动力学是什么？（iii）这些在细胞和分子尺度上的达尔文相互作用如何影响肿瘤生长的组织尺度变化？

我们通过研究从TRAMP，PTEN和KPC动物的肿瘤中获得的肿瘤亚群来解决第一个问题，这些动物经过基因工程改造而形成了原发性癌症（6-8）。在某些情况下（PTEN和TRAMP），亚群源自相同的肿瘤。在每个肿瘤中，我们发现两个并存的亚群具有不同的适应性策略，它们在培养物中保持稳定：
　

一种侵入性表型，即使在有氧的情况下，也会通过上调发酵葡萄糖途径产生过量的酸。

维持近乎正常的葡萄糖代谢的非侵入性，血管生成性，非运动性表型。

在其他小鼠肿瘤（9）以及临床乳腺癌（10），结肠癌（11），皮肤癌（12）和多形性胶质母细胞瘤（13）中，已经报道了侵袭性和血管生成亚群共存。这表明这是普遍现象。

我们通过应用多尺度数学模型（见上文；参考文献4、5、14）来定义自适应策略之间的生态进化竞争，从而解决第二个问题。模型仿真表明，侵入性糖酵解亚群通常更健康，因此在大多数肿瘤环境中更为丰富。但是，模型仿真还表明，如果侵入性表型的这种成本/收益比因成本的小幅增加或收益的下降而反转，则达尔文的动态可能会逆转，从而导致侵入性种群显着下降。

在TRAMP小鼠模型中测试了这些预测，该模型在约12周龄时发展为原发性前列腺癌，并在52周内死亡。原发性和转移性病变中亚群的IHC证实了模型预测，即侵入性，产酸，糖酵解表型（称为C2）是最丰富的人群。然后，当肿瘤局限于导管（即原位或前列腺上皮内瘤样病变）时，在4周龄时向饮用水（15、16）中添加200 mmol / L NaHCO3，从而增加肿瘤内细胞外pH（pHe）0.2个单位。尸检时，这产生了显着的种群转移，有利于非侵入性，血管生成，不产酸（称为C3）表型。要使已建立肿瘤的pHe升高类似，需要向水中添加400 mmol / L NaHCO3，并且在剖检时，C3表型是这些肿瘤的主要种群。

为了解决第三个问题，我们观察到在接受4周治疗的队列中，由于C3表型没有穿透基底膜，因此肿瘤几乎完全处于导管内，从而防止了侵袭性原发性肿瘤的发展。同样，在已确诊肿瘤的队列中，原发和转移性生长明显减少。

我们进一步研究了实验性肿瘤中的问题2和3，该实验肿瘤是由侵袭性人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和非侵袭性人类乳腺癌细胞系MCF7混合注入裸鼠的乳腺脂肪垫构成的。在体外，MDA-MB-231细胞表现出具有高水平运动性的C2样表型，并显着上调有氧糖酵解和产酸。 MCF7细胞呈C3样，葡萄糖代谢接近正常，运动和侵袭水平较低。在体内，MCF7细胞具有高度血管生成作用（17）。类似于C2 / C3二分法，MDA-MB-231细胞是未治疗动物中的主要种群。但是，当将NaHCO3添加到饮用水中时，MCF7种群大大增加，MDA-MB-231种群减少，并且肿瘤的生长明显减慢。

材料和方法
细胞培养
使用获自ATCC（ATCC，CRL-2731，-2733）的小鼠TRAMP-C2，TRAMP-C3细胞系进行实验。两种细胞系均在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素，100 nmol / L DHEA和0.005 mg / mL胰岛素的DMEM培养基中生长。从ATCC（ATCC，CRL-3033，-3031）获得MCF7细胞，MDA-MB-231，PTEN-P8和PTEN-CaP8细胞系，并保存在补充的RPMI培养基1640（Life Technologies Gibco，11875-093）中在标准细胞培养条件下使用10％FBS（HyClone实验室）。 UN-KPC-960和UN-KPC-961胰腺细胞系通过MTA从Batra博士（内布拉斯加州大学医学中心，内布拉斯加州奥马哈市）获得，并保存在含有热灭活的FBS，1-谷氨酰胺（200 mmol / L）的DMEM中。 L），100个非必需氨基酸（100 mmol / L），碳酸氢钠，HEPES缓冲液，庆大霉素（50 mg / mL）和青霉素/链霉素（100μg/ mL）。将所有电池维持在37°C和5％CO2下。所有步骤均在无菌条件下于组织培养罩中进行。

所有电池均在购买后的6个月内使用，并已通过短串联重复（STR）分析进行了重新验证。所有细胞均在2012年至2015年之间获得。除MDA-MB-231外，所有细胞均用于16岁以下的传代。所有细胞均无支原体。到达后6个月内，除MCF7细胞MDA-MB-231外，所有细胞均已使用。 MCF7细胞MDA-MB-231已通过Moffitt癌症中心（Tampa，FL）的分子生物学核心中的STR分析验证。

动物，繁殖与治疗
以前已经描述了TRAMP小鼠的繁殖（18）。简而言之，使用表达与非转基因C587BL / 6雄性小鼠（也获自The Jackson Laboratory）杂交的TRAMP转基因的杂合雌性小鼠（也获自杰克逊实验室（Jackson Laboratory））开发了繁殖群体，并对后代进行了耳穿孔基因分型。根据美国国家卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》和当地机构动物护理和使用委员会的指导原则，将动物饲养在干净的设施（USF Vivarium，位于莫菲特癌症研究中心）。将获得的4周龄的TRAMP小鼠随机分为阳性对照组和治疗组。将碳酸氢钠（200或400 mmol / L）溶解在自来水中，并从4周龄和10周龄开始供TRAMP小鼠饮用。监测小鼠的水消耗和体重并将其与饮用自来水的小鼠（对照）进行比较。包括非转基因小鼠作为阴性对照。所用动物的数量包括在相应实验的图例中。

将一组30 nu / nu小鼠（Harlan）注射到乳腺脂肪垫中，其中含有1×107 MDA-MB-231细胞或1×107 MCF7细胞，或由先前各细胞系的5×106组成的混合物。在细胞注射前一周，将雌激素沉淀（0.72mg低释放，美国创新研究）植入所有小鼠中。注射肿瘤三天后，将小鼠随机分为治疗组和未治疗组（对照组）：对照组n = 4，治疗组n = 6。处理过的小鼠的饮用水中碳酸氢盐含量为400 mmol / L，而其他小鼠则使用常规自来水。使用MRI T2快速自旋回波脉冲序列（TE / TR = 60/900 ms）每周测量一次肿瘤体积，轴向面内分辨率为273μm，切片厚度为1.5 mm。实验开始五周后，收集肿瘤并对苏木精和曙红（H＆E）和雌激素受体（ER）的表达进行染色。对IHC切片进行了分析，如下面组织学部分所述。

耗氧量和细胞外酸化测量
TRAMP-C2和C3，MCF7，MDA-MB-231，PTEN-P8，PTEN-CaP8，KPC 960，KPC 961细胞系和正常人的实时基础氧消耗（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）使用Seahorse细胞外通量（XF-96）分析仪（Seahorse Bioscience）确定原代前列腺上皮细胞（PCS）。 XF-96实时测量单层细胞上方培养基中氧气和游离质子的浓度。在存在或不存在2 g / L d-葡萄糖的情况下，将XF微孔板中接种的细胞培养2小时，然后再进行OCR和ECAR测量。使用标准BCA蛋白测定法确定每个孔的蛋白浓度。将OCR和ECAR值标准化为mg /蛋白质，并绘制为平均值±SD。在分析设计之前未计算样品量。在Seahorse分析中，在任何给定的一天，每组分析多个独立的孔（样品重复），每种条件下每种测量重复3至5次（技术重复），并且独立进行多次分析（生物学重复）。对于PTEN-P8和PTEN-CaP8细胞，每个试验每个试验每个组有三个生物学，五个测定和四个技术重复。其中，使用两种不同浓度的寡霉素以确保达到最大有效剂量（1和2μmol/ L）。两种剂量均产生相同的结果，因此将1μmol/ L寡霉素用于后续的生物学复制。对于KPC 960和KPC961，分别测定了1个生物学样品，11个样品和8个样品以及4个技术重复样品。对于MCF7，MDA-MB-231，TRAMP C2，TRAMP C3和PCS，每次测定每个细胞系使用两个生物学的8个样品和3-4个技术重复样品。统计分析在假设高斯分布的情况下，采用未配对t检验和Welch校正。

　

血钠测量
使用带CG8 +药筒的iSTAT便携式临床分析仪（Abaxis）获得血钠浓度。从小鼠的心脏棒中获取血样（约200μL）并将其插入药筒，并根据制造商的规格记录读数。

体内MMPSense 680活性的测量
来自Tap的TRAMP小鼠在第4周和第10周（每个队列n = 6）在32周龄时成像（400 mmol / L NaHCO3）。成像前二十四小时，将可激活的荧光探针MMPSense 680（PerkinElmer）静脉注射给小鼠。然后使用FMT2500（PerkinElmer）断层成像系统对小鼠进行体内成像。使用内标对感兴趣的区域进行量化和归一化。

定量PCR
使用带有SYBR Green的iScript Real-Rime PCR Kit（Bio-Rad，170-8893），在7900HT快速实时系统（Life Technologies Applied Biosystems）上进行所有qRT-PCR。 GAPDH表达用作内部对照。每20μL反应使用mRNA（100 ng）。 TRIzol（Life Technologies Invitrogen）根据制造商的说明用于所有RNA纯化。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从生理pH 7.4的TRAMP-C2和低pH（6.7）处理的细胞沉淀中分离RNA。

MMP-2和MMP-9的引物购自Srikumar Chellepan（H。Lee Moffitt癌症中心和研究所）。引物序列包含在补充材料和方法中。

组织学和图像分析
尸检时，收集肺/心脏，肝脏和泌尿生殖系统。处理组织，将其包埋在石蜡中，获得4至5μm的组织切片。将载玻片用H＆E染色剂染色，并由病理学家对肿瘤组织的存在进行分级。使用带有20x / 0.8NA物镜（200x）的Aperio ScanScope XT通过Basler三线性阵列以每分钟2分钟的速度扫描组织学玻片。 Aperio正像素计数v9.0算法[具有以下阈值：色相值= 0.1；色相宽度= 0.5;颜色饱和度阈值= 0.04; IWP（高）= 220; Iwp（低）= Ip（高）= 175; Ip（低）= Isp（高）= 100 Isp（低）= 0]被用于分割各种强度的阳性染色。将该算法应用于整个数字核心图像，以确定适用区域对阳性生物标志物染色的百分比。

抗体
多克隆兔抗小鼠GLUT-1抗体购自Millipore（07-1401以1：800的浓度使用）。与CD31反应的兔抗体购自Abcam（ab28364;以1：200的浓度使用）;与SMA反应的兔抗体购自Abcam（ab32575；使用的浓度为1：250）；与VEGF反应的兔抗体购自Abcam（ab46154，以1：1,500的浓度使用）。与ER反应的兔抗体购自Abcam（ab32063，以1：250的浓度使用）。根据制造商的规程，使用Ventana Discovery XT自动化系统（Ventana Medical Systems）用专有试剂对玻片进行染色。

细胞迁移和侵袭的体外测定
使用xCELLigence实时细胞分析仪（RTCA，ACEA Biosciences）比较了C2-和C3-TRAMP细胞系的体外运动性和侵袭性以及MDA-MB-231和MCF7的体外运动性。为了进行迁移测定，将细胞以2×104个细胞/孔的CIM16平板接种在含有无血清培养基的上腔室中，其下腔室装有无血清培养基（阴性对照）或含有10％FBS的培养基。通过测量细胞产生的阻抗，细胞指数，实时监测向两个腔室之间的过滤器下表面迁移的细胞数量。为了进行侵袭测定，在上腔室的过滤器上预涂了10％的Cultrex基底膜提取物。监测细胞指数的变化，直至迁移24小时，侵袭72小时。迁移和侵袭试验（xCELLigence）具有三个生物学重复，每个试验每个试验的每个细胞系n = 8。

数据处理
使用Microsoft Excel和GraphPad Prism进行数据处理并计算统计显着性（P≤0.05）。

统计分析
采用两尾未配对的Student t检验确定统计学显着性。小于0.05的P值被认为具有统计学意义或另有指示。曼恩·惠特尼检验是一种非参数统计量，与基于等级的检验家族相似，用于迁移和入侵检测。

　

结果
竞争性肿瘤内人群：C2和C3肿瘤表型
从不同的克隆中建立了TRAMP-C3和TRAMP-C2细胞系，这些克隆是从32周异质TRAMP小鼠肿瘤中分离出来的（6）。两种细胞系均在培养物中增殖并保持稳定的表型。在体内，TRAMP-C2系形成侵袭性肿瘤，而TRAMP-C3则不形成。为了检查它们的代谢谱，将两种细胞系都进行葡萄糖饥饿2小时，然后使用Seahorse细胞外通量（XF）分析仪进行分析。如图1A所示，与TRAMP-C3相比，TRAMP-C2细胞具有显着（P = 0.027）的葡萄糖刺激酸化速率，表明基础糖酵解速率更高。此外，在基本条件下，TRAMP-C3细胞显示出接近最大的糖酵解能力，而在相同条件下，TRAMP-C2细胞却远未达到能力。 C2细胞系的基础OCR也略微但显着（P = 0.0054），高于C3细胞（图1B）。结合起来，图1A和B的数据表明C2细胞的ATP转化率更高，并且对糖酵解发酵的依赖性更高。与TRAMP-C2细胞相比，添加线粒体解偶联剂FCCP可以产生最大的潜在OCR（作为电子传输动力学的量度），并证明TRAMP-C3中的线粒体容量显着更高（P = 0.0082）。

　

图1。
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图1。
A–D，致瘤TRAMP-C2和非致瘤TRAMP-C3细胞系的体外分析。 A，使用Seahorse XFe-96分析仪实时测量ECAR的代谢通量分析。与C3细胞系相比，C2细胞表现出增加的糖酵解。 *，P ＝ 0.0274。糖酵解能力在C2细胞中较高。 **，P ＝ 0.001。 B，两种细胞系的基础OCR没有不同。 C3细胞的呼吸能力略有提高，尽管有显着提高。 **，P ＝ 0.0082。 C，体外运动性，其通过由两种细胞系中的迁移引起的阻抗来测量并且由xCELLigence实时细胞分析仪仪器记录，C2细胞具有高迁移性，并且C3系不活动。 ***，P ＝ 0.0007。 D，通过阻抗增加测量的C2-和C3-细胞之间的侵袭性比较；经transwell迁移分析后，C2细胞更具侵袭性。 **，P ＝ 0.0015。进行了Mann-Whitney统计检验，表明两条时间序列曲线来自不同的种群。迁移和入侵均归一化为增殖速率。

　

结合糖酵解分析（图1A和B），这些结果表明C3系主要通过呼吸作用（即氧化代谢）产生能量，而典型的酸适应性表型C2细胞则具有高度的糖酵解作用。还测量了C2 TRAMP细胞系与正常前列腺上皮细胞系（PCS）相比的代谢谱。与PCS相比，2-DG后的C2品系显示出更高的糖酵解能力，并且ECAR显着降低（P <0.0001）。此外，C2细胞还具有更高的OCR，表明其代谢率，因此，与正常前列腺上皮细胞PCS相比，C2细胞的ATP消耗速率显着提高（P <0.0001）。（补充图S1A–S1D）。 C2细胞中较高的糖酵解速率，而不是满足整体细胞ATP需求，可能更表明质膜上对ATP产生的分隔需求，如参考文献1中所述。 16.在糖酵解增加的细胞中经常但并非总是观察到GLUT-1的表达。我们的IHC结果（补充图S2A和S2B）显示，在轻敲治疗的小鼠的恶性更高的TRAMP肿瘤组织中，GLUT-1升高，而在碳酸氢盐治疗的小鼠的恶性程度更低的肿瘤中，GLUT-1明显降低（P = 0.002）（参见下文））。我们解释这些发现，以表明具有较高GLUT-1水平的更恶性TRAMP肿瘤也具有较高的葡萄糖刺激酸产生率。

癌细胞中高速率的糖酵解和产酸支持快速，侵袭性和转移性生长（19）。因此，我们使用无xCELLigence标签的平台研究了两种细胞系的迁移和侵袭能力（请参阅材料和方法）。图1C显示了在存在和不存在FBS的情况下，每条细胞系的迁移能力，以衡量阻抗（细胞指数）。 C2细胞具有显着（P = 0.0015）的高迁移速率，在没有FBS的情况下降低了迁移速率，而C3细胞在两种条件下均没有迁移能力。图1D显示了跨孔迁移测定法中阻抗的增加，其中细胞必须越过Matrigel屏障朝向含有FBS作为化学吸引剂的下部孔穿过，以产生信号。与迁移分析相似，与C3相比，C2细胞系的侵袭性显着（P = 0.0007）。
　

侵入性生态位工程表型是否与其他癌症中非侵入性，不产酸的人群竞争？
“生态位建设”是一个生态术语，用于描述微环境的改造以使入侵或已建立的物种受益。我们采用这个术语来描述入侵癌细胞以为其提供最大利益的方式修改其局部微环境的能力，同时降低宿主组织的适应性。如上所述，在绝大多数人类癌症中，FdG PET成像显着增加了葡萄糖摄取的观察结果表明，利基构建表型是体内癌症的共同特征。系统地研究所有癌症类型超出了本报告的范围。但是，我们确实调查了从PTEN无效的转基因小鼠中分离的前列腺上皮细胞，这些小鼠要么是杂合子（PTEN-P8）要么是纯合子（PTEN-CaP8）缺失了PTEN（补充图S3A和S3B；参考文献7），以及上皮胰腺衍生自KrasG12D; Trp53R172H; Pdx1-Cre（KPC）模型，UN-KPC-960和UN-KPC-961的细胞系（补充图S4A和S4B;参考文献8）。我们观察到，类似于C2 / C3表型二分法，PTEN-P8细胞是非致瘤性的，UN-KPC-960是非转移性的，并且都依赖于氧化代谢，而致瘤性PTEN-CaP8和转移性的UN-KPC-961细胞是高度致癌的。糖酵解（分别为P <0.01和P <0.001）。在其他小鼠肿瘤（6）以及临床乳腺癌（7），结肠癌（8）和皮肤癌（9）以及多形性胶质母细胞瘤（10）中，已经报道了侵袭和血管生成亚群共存。这些数据表明，同一肿瘤内癌细胞的代谢表型二分法可能是普遍现象。

　

C3表型增加了TRAMP小鼠的血流量
我们认为C2型细胞的产酸是一种利基结构的形式，它可以使细胞侵入周围的组织，大概是在吸收血管。但是，我们注意到，C3型细胞也可能参与了相对无创的利基构建策略，其中它们通过促进功能性血管的向内生长来最大化增殖。使用动态对比增强MRI的体内研究（图2A和B）表明，与对照组相比，碳酸氢盐治疗的肿瘤（主要为C3型，见下文）观察到显着（P <0.0001）增加并且观察到空间上更均匀的血流（图2C）。处死后对肿瘤的进一步IHC分析表明，经碳酸氢盐处理的肿瘤每单位面积的血管数量明显更高（P = 0.0004），血管直径更小（P = 0.029），平滑肌肌动蛋白的表达更高（P = 0.04））和VEGF表达下降（P = 0.03），也与血管正常化一致（补充图S5A–S5F）。
　

图2。
碳酸氢盐对TRAMP灌注的影响。 A–C，使用g基动态对比增强（DCE）-MRI评估肿瘤的脉管系统（灌注和通透性），A，拍打组和200例TRAMP前列腺肿瘤冠状面上DCE-MRI的代表性图像显示了mmol / L碳酸氢盐基团。在时间0（（注射之前）和）注射后4、7和10分钟获得图像。色标表示前列腺中信号强度的增量增加。 B，使用MATLAB对信号强度的初始AUC进行数据分析，显示在200 mmol / L碳酸氢盐治疗组中较高的血流量（****，P <0.0001）。 C，在10分钟时增强的统计分析，显示平均信号强度±SD，以及增强值±SD的直方图的偏斜度。平均值表明与轻敲对照相比，治疗的增强显着增加（P = 0.001）。此外，与碳酸氢盐组（P = 0.03）相比，拍打组中的增强像素分布更正态（P = 0.03），我们将其解释为偏向更高灌注值的新脉管系统的募集。两尾学生t检验用于计算统计显着性。

肿瘤内竞争进化动力学的数学模型
为了检查控制这些竞争亚群相互作用的达尔文动力学，我们基于混合细胞自动机范式扩展了我们的多尺度数学模型（4、5），以纳入管道几何形状。该模型捕获了竞争性肿瘤细胞表型和微环境选择力（例如氧，葡萄糖和酸中毒）的复杂时空相互作用（图3A和B）。该模型的详细信息之前已经发布过（4、5、20），但是核心元素在图3A和B，方程式和假设快速指南以及补充方法中进行了说明。模型仿真表明，利基构建表型将是占主导地位的肿瘤亚群，该表型的侵袭性对于从原位癌向侵袭性癌的转移以及原发性和转移性肿瘤的侵袭性生长至关重要（图3C–E）。
　

图3。
来自不同起始时间和剂量碳酸氢钠的肿瘤生长的多尺度数学模型的结果。 A，脉管系统，氧气和酸中毒（黄色）中微环境成分与肿瘤细胞表型（有氧，绿色；耐酸，蓝色；糖酵解，红色；糖酵解和耐酸，粉红色）之间的相互作用模型。 B，每个肿瘤细胞遵守的细胞生命周期流程图，显示氧气，pH，ATP和空间的输入参数，以及导致细胞静止，死亡或增殖的决定。 C和D，表型空间（C）和物理空间（D）在以下治疗条件下显示为t = 200天：（i）早期给予低剂量碳酸氢盐（t = 40天）；（ii）尽早给予高剂量；（iii）晚期（t = 150天）给予低剂量；（iv）迟给予高剂量；（v）不治疗。每次模拟的初始条件相同，并在D的每个面板中显示为插图S。对于每次模拟，肿瘤细胞的颜色与其在表型空间中的位置相对应，其中水平轴表示糖酵解能力的水平，纵轴是耐酸性的量。显示了对应于C2（蓝色/品红色）和C3（绿色）表型的估计区域。 E，相应的生长曲线，肿瘤大小（以mm2为单位的面积）和以天为单位的时间。模拟窗口（D）的尺寸约为4.5×4.5 mm（请参阅补充影片S1）。

我们假设侵入性的利基结构表型的成本/收益比可能足够接近统一性，以致于分子或分母的微小变化会降低种群适应度并选择竞争性非侵入性表型。我们通过在40或150天时通过使用全身性缓冲液使细胞外pHe略有增加之后，检查肿瘤内的进化动力学，从而通过计算机测试了这一假设。图3和补充影片S1中的时间图显示了处理和对照的生长动态。对照具有两个生长阶段：首先，肿瘤种群的生长受到与周围正常细胞竞争的约束。在大约t = 120天时，C2样侵入性小生境构建表型已经进化，将生长速率提高了7倍。图1和图2显示了在t = 200天时治疗前浸润性原位肿瘤的模拟结果。图3D的图2。高剂量和低剂量治疗均得到了检查，并且足以阻止小生境构建表型的演变，以致于C3样非侵入性表型在人群中仍然占主导地位，而肿瘤从未成为侵入性的。因此，以牺牲C2样竞争者为代价来促进C3样细胞的这种策略阻止了浸润性癌症的发展。

　

然后，我们检查了生长中的原发癌中的环境扰动。在这里，C2样侵入性表型已经进化，并且由于其适应性优势而成为优势人群，而C3样非侵入性细胞仅在少数人群中存在。给予高剂量和低剂量的全身缓冲液后，肿瘤的最终中位表型如图3C所示。在这些模型中，未经治疗的肿瘤以C2样细胞为主，低剂量缓冲液的使用并未显着改变种群动态。但是，如图3C和补充电影S1所示，较高剂量的缓冲液会显着改变中位表型（青色点），特别是在治疗过程中，优势种群从C2类迁移回C3类。因此，该模型预测，在环境条件下相对较小的扰动会诱导种群相变，并特别选择无创癌细胞表型。

在TRAMP肿瘤中测试模型预测
该数学模型做出了两个与TRAMP小鼠体内种群动态有关的明确预测：（i）原位肿瘤pHe的微小变化将选择非侵入性的C3样表型，这将防止侵袭性癌症的发展和（ ii）浸润性癌症的pHe改变可产生有利于C3样表型的种群相变，并显着降低肿瘤的生长速度。

我们通过向饮用水中添加200 mmol / L NaHCO3来测试预测（i），这将使前列腺内pHe增加（P <0.04）pH平均为0.2（±0.04）个单位。通过电极测量了不同浓度的碳酸氢盐引起的前列腺内pHe的升高（图4A）。两组的血清钠浓度（补充图S6A）相同，表明全身代谢性碱中毒被完全补偿。如先前研究（18、21、22）中观察到的，与对照组相比，治疗组的小鼠体重无显着差异。显然由于钠的作用，碳酸氢钠对小鼠的摄水量增加了（补充图S6B和S6C）。

图4。
在TRAMP模型中减少肿瘤生长。 A，在安乐死之前立即获得200 mmol / L碳酸氢盐处理组和400 mmol / L碳酸氢盐处理组（每个组n = 3）的自来水前列腺的体内测量值。使用单桶pH微电极MI-419（Microelectrode，Inc.）测量pH。结果表明，与自来水动物相比，经碳酸氢盐处理的动物的pH值具有统计学上的显着增加。 *，P ＝ 0.015； *，P ＝ 0.04。显示了平均值±SEM。 B，不同治疗方法的前列腺体积测量；非转基因（n = 5），TAP（n = 7），200 mg / L碳酸氢盐开始晚期处理（n = 5），200 mmol / L碳酸氢盐早期处理（n = 5）和400 mmol / L晚期处理通过美国成像获得的碳酸氢盐（n = 7）队列。数据显示，在整个研究过程中，于4周龄接受更高剂量（400 mmol / L碳酸氢钠）治疗的小鼠，前列腺体积始终保持减少（*，P = 0.016），而晚期治疗的小鼠（从10周开始）仅表现出降低24周时的血容量（*，P = 0.03）。 C，前列腺肿瘤的组织学定量分析显示在不同治疗人群的前列腺肿瘤中与良性和恶性表型有关的像素百分比。这些结果显示，与其他组相比，在经过4周龄治疗的小鼠中观察到的良性和恶性肿瘤百分比显着不同，并且在后期用增加的剂量进行了治疗。 *，P = 0.017和*，P = 0.03。使用两尾学生t检验来计算统计学显着性。

与先前的观察一致，我们发现在第4周添加全身性缓冲液可防止从原位癌向浸润性癌的转变。 IHC对已治疗和未治疗肿瘤的评估（见下文）证实，C2表型主导了未治疗肿瘤群，而仍处于导管内（即未穿透基底膜）的已治疗动物中的肿瘤细胞表现出表型类似于C3电池（补充图S7A）。

对预测（ii）进行了测试，方法是在10周龄时向饮用水中添加碳酸氢钠，从而在已经由C2细胞控制的浸润性肿瘤中进行测试。与数学模型预测一致，在24周的时间点与对照组相比，从10周开始用400 mmol / L碳酸氢钠治疗的组显示出明显的（P = 0.03）减慢原发性肿瘤生长（图4B）。尸检时，IHC显示在治疗的肿瘤中占主导地位的人群是C3表型（补充图S2和S5）。与增长相比，这种人口迁移除了增长较慢外，还表现出与对照组相比组织学分级显着降低（P = 0.03）（图4C）。

选择C3表型可减少转移
由于转移性肿瘤的生长需要在原发肿瘤的部位和转移部位都进行侵袭性生长，因此我们假设选择非侵袭性C3表型将减少继发性肿瘤的形成。为了对此建模，我们通过在高剂量，低剂量和不进行治疗的条件下，将具有不同表型的单细胞放入正常组织区域中，模拟了缓冲疗法对一系列转移性肿瘤种子的影响。运行模拟直到t = 120天，此时测量转移的大小。结果（图5A）表明，大剂量全身性缓冲液的总体效果将取决于治疗时循环表型的分布和大小。然而，与原发性肿瘤一样，该模型预测高剂量的全身性缓冲液将显着抑制转移性肿瘤的生长。

图5。
在TRAMP模型中减少肿瘤转移。 A，未经处理（绿色曲线），低剂量（红色）和高剂量（蓝色）缓冲液治疗下转移的模拟生长。水平轴代表初始转移种子细胞的表型。从图4C的表型图中沿对角白线的位置选择种子，其中该图中的0值对应于位置S（正常表型），而值1对应于最耐糖酵解和耐酸的表型。，图4A的右上角。作为参考，颜色渐变代表种子表型，其中C3和C2细胞类型已标记。垂直轴显示转移的最终大小，单位为mm2，在转移细胞接种后的t = 120天时测量。从t = 0开始进行缓冲疗法，直到模拟结束。每个点是四次运行的平均值。大剂量疗法可抑制所有种子类型的转移。在低剂量治疗下，侵略性C2种子仍会生长。 B，肺和肝转移图像（分别来自三个不同的治疗队列）。在轻敲队列中，我们观察到了转移，而在碳酸氢盐治疗的队列中，观察到了最小的转移。黑色箭头，正常组织；白色箭头，转移。 C，量化三个不同队列的肺和肝转移，显示早期治疗和晚期治疗组的肺转移显着降低（**，P = 0.001）。（*，P = 0.03）对于肝脏，与拍打相比，*，早期治疗的P = 0.01，晚期治疗的*，P = 0.02。显示了平均值±SEM。使用两尾学生t检验来计算统计学显着性。

根据这些数学模型的结果，我们然后研究了在10周时开始使用更高剂量（400 mmol / L）的NaHCO3是否可以抑制转移的发展。与对照组相比，转移至肺和肝的转移较少，其定量显示治疗组明显减少（P <0.03）。

转移需要释放各种蛋白酶，包括金属蛋白酶（MMP；参考文献23、24）。为了检查体内的MMP活性，我们在28周分析前24小时通过尾静脉注射了MMP可激活的荧光探针（MMPSense 680，请参见材料和方法）（补充图S8A）。与对照组相比，图像量化显示在4周和10周的碳酸氢盐治疗的队列中，活动明显降低（P <0.05）。体外对照先前已经表明，在这些实验的范围内，这些探针的活性不依赖于pH（25）。使用qRT-PCR，我们证明了MMP-9 mRNA表达在C2中被酸中毒特异性上调，与MMP-2，-3和-13相反（补充图S8C）。

TRAMP小鼠的结果可以在其他实验模型中复制吗？
为了测试我们的结果在TRAMP小鼠中的广泛适用性，我们设计了一项实验，该实验研究了两种代谢不同的乳腺癌细胞系：非侵入性MCF7和高度侵入性MDA-MB-231的体内竞争。在体外，我们证明了（补充图S9A–S9C），MDA-MB-231细胞具有很高的糖酵解性（P <0.0001），产酸，能动性和与C2细胞相似的侵袭性，而MCF7细胞是无侵害性，非能动性，并表现出与C3细胞相似的近乎正常的葡萄糖代谢。 IHC结果显示，与MCF7细胞相比，恶性程度更高的MDA-MB-231肿瘤组织中GLUT-1明显升高（P = 0.0013）（补充图S9D）。我们改造了MCF7和MDA-MB-231细胞，分别表达eGFP和红色荧光蛋白（RFP）。在体外，我们用两个种群形成了球体，最初在有或没有Matrigel的情况下均混合均匀（每种条件下n = 8）。在数小时内，细胞迅速移动，建立了独特而一致的空间混合状态，MDA-MB-231细胞形成了球体的表面，MCF7和MCF7细胞仅在球体的中心区域内（补充图S10）。将来自两种细胞系的充分混合的细胞以相同数量共注射到受体SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。在肿瘤注射之前将雌激素沉淀物皮下放置以允许ER + MCF7细胞生长。相对的GFP和RFP荧光用于定性监测这些动物的肿瘤生长，并确定了进行终点评估的适当时间。植入21天后处死动物，并通过IHC对切片的ER阳性评分，以鉴定群体中的MCF7细胞。在这些研究中，对ER表达的IHC分析是优选的终点，因为它在CLIA环境中具有很高的重现性，并且可以以逐像素的方式以二进制方式进行定量。相反，由于光的穿透和散射以及微环境（pH和氧气）对荧光蛋白成熟的已知影响，GFP和RFP荧光难以量化。在对照动物中，ER- MDA-MB-231细胞是终点的主要种群。但是，在用400 mmol / L NaHCO3处理的小鼠中，治疗组的ER + MCF7细胞数量显着增加（P <0.0001）（图6A和B；补充图S11）。此外，该群体相变与肿瘤生长速率降低同时发生（图6C）。

图6。
A，顶部图像是在不同处理下每种细胞系和混合物（MDA-MB-231和MCF7，1：1）的代表性肿瘤的H＆E图像。下图是与H＆E中相同肿瘤的连续切片的ER染色。 B，在该实验中使用的所有肿瘤中ER表达的分析。请注意，用碳酸氢盐400 mmol / L处理的那些肿瘤（由MDA-MB-231和MCF7的混合物（1：1组成））中的ER表达要比自来水中的更大（P = 0.0001）。 C，该实验中使用的所有肿瘤的MRI体积数据。数据表示为肿瘤体积相对于肿瘤注射后天数的变化倍数。显示了平均值±SEM。使用两尾学生t检验来计算统计学显着性。

图7。
生态位建设进化策略操纵模型。我们的假设是，肿瘤由两个不同的细胞亚群组成：高度糖酵解的产酸细胞（红细胞）和非糖酵解的非产酸细胞（蓝细胞）。我们的模型预测，pHe的微小扰动可能会诱导种群相变，从而有利于非产酸，非侵袭性癌症人群。 PIN，前列腺上皮内瘤变。

因此，我们的模型表明对照肿瘤中的优势种群显示出C2表型的代谢和侵袭策略，而治疗队列中的优势肿瘤群体则表现出C3表型，这与对肿瘤大小，组织学分级和转移的影响一致（图7）

讨论
显然，肿瘤内进化产生了多个遗传定义的竞争亚群。在这里，我们研究了这些亚群的适应策略，尽管可能有很多，但它们侧重于从三种不同的自发肿瘤模型提取后在培养物中稳定维持的两种表型。

每个人都在设计当地的生态系统，以促进自身的扩散并破坏竞争对手。血管生成表型促进血管向内生长以增加承载能力并增加增殖。但是，该表型促进相对紧凑和缓慢的肿瘤生长。模型预测与“推动”肿瘤边缘的组织学观察结果一致，通常可以带来良好的预后（26）。相反，通过酸化环境，侵入性表型受益于酸介导的竞争性癌细胞适应策略的抑制，抑制对肿瘤抗原的免疫应答以及细胞外基质的降解，从而促进了入侵。先前的研究表明，增加的产酸与入侵密切相关（27），最近的全基因组计算分析表明，有氧糖酵解与细胞运动之间存在高度相关性（28）。从组织学上讲，该表型表现为“浸润”边界，预后不良（26）。

在正在进行的肿瘤内进化中，每种适应策略的益处都与成本进行权衡。对于侵入性策略，成本包括由于有氧糖酵解和适应酸性环境的代谢需求（例如，由于膜质子泵）而导致的能量生产效率降低。由于绝大多数原发性和转移性癌症在FdG PET成像中显示出越来越多的葡萄糖蓄积，因此利基构建的好处似乎通常会超过成本。

在这里，我们问：这种明显的优势对外部干扰有多强？复杂的动力学系统（例如癌症）通常由非线性交互作用主导，这些动力学难以直观地预测。因此，实验工作是在数学模型的指导下进行的，这表明即使pHe的微小变化也可能降低侵入性糖酵解表型的适应性优势，导致种群相变（图3），有利于非产酸非侵入性表型。

　

在TRAMP小鼠中证实了这一预测，因为前列腺内或肿瘤内pHe的微小变化促进了非侵入性表型并显着改变了肿瘤的生长方式。为了明确研究这两种适应性策略之间的竞争，我们使用两种乳腺癌细胞系构建了一个实验性肿瘤：低侵袭性，代谢接近正常，血管生成的MCF7细胞和高侵袭性，高度糖酵解，分泌酸的MDA-MB-231细胞。与TRAMP小鼠中的模型预测和观察结果一致，我们发现MDA-MB-231细胞成为体内的优势种群。但是，当在饮用水中添加400 mmol / L NaHCO3重复进行实验时，MCF7细胞变得受宠，肿瘤的生长明显减慢（图6；补充图S11）。

总而言之，我们证明，与其他复杂的动力系统一样，通过应用相对较小但高度选择性的生物学“力”，可以将癌症引导到侵略性较低的过程中。即使没有对每个组成部分的全面了解，也可以实现这一目标。通过应用数学模型捕获系统中的关键非线性非线性达尔文动力学。

Defining Cancer Subpopulations by Adaptive Strategies Rather Than Molecular Properties Provides Novel Insights into Intratumoral Evolution

Arig Ibrahim-Hashim, Mark Robertson-Tessi, Pedro M. Enriquez-Navas, Mehdi Damaghi, Yoganand Balagurunathan, Jonathan W. Wojtkowiak, Shonagh Russell, Kam Yoonseok, Mark C. Lloyd, Marilyn M. Bui, Joel S. Brown, Alexander R.A. Anderson, Robert J. Gillies and Robert A. Gatenby

DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-16-2844 Published May 2017

Abstract
Ongoing intratumoral evolution is apparent in molecular variations among cancer cells from different regions of the same tumor, but genetic data alone provide little insight into environmental selection forces and cellular phenotypic adaptations that govern the underlying Darwinian dynamics. In three spontaneous murine cancers (prostate cancers in TRAMP and PTEN mice, pancreatic cancer in KPC mice), we identified two subpopulations with distinct niche construction adaptive strategies that remained stable in culture: (i) invasive cells that produce an acidic environment via upregulated aerobic glycolysis; and (ii) noninvasive cells that were angiogenic and metabolically near-normal. Darwinian interactions of these subpopulations were investigated in TRAMP prostate cancers. Computer simulations demonstrated invasive, acid-producing (C2) cells maintain a fitness advantage over noninvasive, angiogenic (C3) cells by promoting invasion and reducing efficacy of immune response. Immunohistochemical analysis of untreated tumors confirmed that C2 cells were invariably more abundant than C3 cells. However, the C2 adaptive strategy phenotype incurred a significant cost due to inefficient energy production (i.e., aerobic glycolysis) and depletion of resources for adaptations to an acidic environment. Mathematical model simulations predicted that small perturbations of the microenvironmental extracellular pH (pHe) could invert the cost/benefit ratio of the C2 strategy and select for C3 cells. In vivo, 200 mmol/L NaHCO3 added to the drinking water of 4-week-old TRAMP mice increased the intraprostatic pHe by 0.2 units and promoted proliferation of noninvasive C3 cells, which remained confined within the ducts so that primary cancer did not develop. A 0.2 pHe increase in established tumors increased the fraction of C3 cells and signficantly diminished growth of primary and metastatic tumors. In an experimental tumor construct, MCF7 and MDA-MB-231 breast cancer cells were coinjected into the mammary fat pad of SCID mice. C2-like MDA-MB-231 cells dominated in untreated animals, but C3-like MCF7 cells were selected and tumor growth slowed when intratumoral pHe was increased. Overall, our data support the use of mathematical modeling of intratumoral Darwinian interactions of environmental selection forces and cancer cell adaptive strategies. These models allow the tumor to be steered into a less invasive pathway through the application of small but selective biological force. Cancer Res; 77(9); 2242–54. ©2017 AACR.

Major Findings
Defining intratumoral subpopulations by their adaptive strategies rather than the molecular properties used in branching clonal evolution models allows the cellular and environmental interactions to be identified and framed mathematically. With sufficient understanding of the underlying eco-evolutionary forces, the tendency of complex dynamic systems to magnify small perturbations can be exploited to steer a tumor into a noninvasive growth regime by applying relatively small biological perturbations.

Defining Cancer Subpopulations by Adaptive Strategies Rather Than Molecular Properties Provides Novel Insights into Intratumoral Evolution | Cancer Research
https://cancerres.aacrjournals.org/content/77/9/2242

　

Published: 01 November 2004
Why do cancers have high aerobic glycolysis?
Robert A. Gatenby & Robert J. Gillies

Abstract
If carcinogenesis occurs by somatic evolution, then common components of the cancer phenotype result from active selection and must, therefore, confer a significant growth advantage. A near-universal property of primary and metastatic cancers is upregulation of glycolysis, resulting in increased glucose consumption, which can be observed with clinical tumour imaging. We propose that persistent metabolism of glucose to lactate even in aerobic conditions is an adaptation to intermittent hypoxia in pre-malignant lesions. However, upregulation of glycolysis leads to microenvironmental acidosis requiring evolution to phenotypes resistant to acid-induced cell toxicity. Subsequent cell populations with upregulated glycolysis and acid resistance have a powerful growth advantage, which promotes unconstrained proliferation and invasion.

Key Points
Widespread clinical use of 18fluorodeoxyglucose positron-emission tomography has demonstrated that the glycolytic phenotype is observed in most human cancers.

The concept of carcinogenesis as a process that occurs by somatic evolution clearly implies that common traits of the malignant phenotype, such as upregulation of glycolysis, are the result of active selection processes and must confer a significant, identifiable growth advantage.

Constitutive upregulation of glycolysis is likely to be an adaptation to hypoxia that develops as pre-malignant lesions grow progressively further from their blood supply. At this stage, the blood supply remains physically separated from the growing cells by an intact basement membrane.

Increased acid production from upregulation of glycolysis results in microenvironmental acidosis and requires further adaptation through somatic evolution to phenotypes resistant to acid-induced toxicity.

Cell populations that emerge from this evolutionary sequence have a powerful growth advantage, as they alter their environment through increased glycolysis in a way that is toxic to other phenotypes, but harmless to themselves. The environmental acidosis also facilitates invasion through destruction of adjacent normal populations, degradation of the extracellular matrix and promotion of angiogenesis.

We propose that the glycolytic phenotype, by conferring a powerful growth advantage, is necessary for evolution of invasive human cancers.

Why do cancers have high aerobic glycolysis? | Nature Reviews Cancer
https://www.nature.com/articles/nrc1478

　

Cell Cycle. 2019 Jun;18

Proliferating tumor cells mimick glucose metabolism of mature human erythrocytes

Mehrdad Ghashghaeinia 1, Martin Köberle 2, Ulrich Mrowietz 1, Ingolf Bernhardt 3

1a Department of Dermatology , University Medical Center Schleswig-Holstein, Campus Kiel , Kiel , Germany.
2b Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Allergologie, Fakultät für Medizin , Technische Universität München , Munich , Germany.
3c Laboratory of Biophysics, Faculty of Natural and Technical Sciences III , Saarland University , Saarbruecken , Germany.

Abstract
Mature human erythrocytes are dependent on anerobic glycolysis, i.e. catabolism (oxidation) of one glucose molecule to produce two ATP and two lactate molecules. Proliferating tumor cells mimick mature human erythrocytes to glycolytically generate two ATP molecules. They deliberately avoid or switch off their respiration, i.e. tricarboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) machinery and consequently dispense with the production of additional 36 ATP molecules from one glucose molecule. This phenomenon is named aerobic glycolysis or Warburg effect. The present review deals with the fate of a glucose molecule after entering a mature human erythrocyte or a proliferating tumor cell and describes why it is useful for a proliferating tumor cell to imitate a mature erythrocyte. Blood consisting of plasma and cellular components (99% of the cells are erythrocytes) may be regarded as a mobile organ, constantly exercising a direct interaction with other organs. Therefore, the use of drugs, which influences the biological activity of erythrocytes, has an immediate effect on the entire organism.

细胞周期Cell Cycl.2019年6月18日

增生的肿瘤细胞模仿成熟人体红细胞的葡萄糖代谢

Mehrdad Ghashghaeinia 1, Martin Koberle 2, Ulrich Mrowietz 1, Ingolf Bernhardt 3

石勒苏益格-荷尔斯泰因大学医学中心皮肤科1a部，基尔校区，基尔，德国。

德国慕尼黑工业大学，Klinik和Poliklinik fur Dermatologie和Allergologie, Fakultat fur Medizin

德国萨尔大学自然与技术科学系生物物理3c实验室，萨尔布鲁肯。

摘要

成熟的人体红细胞依赖于无氧糖酵解，即一个葡萄糖分子的分解(氧化)产生两个ATP和两个乳酸分子。增殖的肿瘤细胞模仿成熟的人类红细胞，在糖酵解过程中产生两种ATP分子。它们故意避免或关闭它们的呼吸作用，即三羧酸(TCA)循环和氧化磷酸化(OXPHOS)机制，从而避免从一个葡萄糖分子产生额外的36个ATP分子。这种现象被称为有氧糖酵解或瓦伯格效应。目前的综述处理葡萄糖分子进入成熟的人红细胞或增殖的肿瘤细胞后的命运，并描述为什么它是有用的增殖的肿瘤细胞模仿成熟的红细胞。由血浆和细胞组成的血液(99%的细胞是红细胞)可以看作是一个移动的器官，不断地与其他器官发生直接的相互作用。因此，影响红细胞生物活性的药物的使用，对整个机体有立竿见影的影响。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31154896/

　