通过光动力疗法刺激抗肿瘤免疫

Stimulation of anti-tumor immunity by photodynamic therapy

日光浴实际上是一种光动力疗法

Reported by Harvard Medical School

光动力疗法（PDT）是一种快速发展的癌症治疗方法，它利用无毒染料和无害可见光的组合，通过产生活性氧来破坏肿瘤。 PDT在急性炎症的情况下产生肿瘤细胞破坏，其作为先天免疫系统的“危险信号”。先天免疫系统的激活增加了肿瘤特异性T淋巴细胞的启动，这些T淋巴细胞具有识别和破坏远处肿瘤细胞的能力，并且此外导致免疫记忆的发展，其可以在稍后的时间点抵抗癌症的复发。 PDT还可以成功地与免疫调节策略组合，所述免疫调节策略能够克服或绕过进展中的肿瘤用于逃避免疫攻击的逃逸机制。本文将介绍免疫反应在PDT抗肿瘤有效性中的作用。它将突出PDT介导的抗肿瘤免疫发展的里程碑，并强调可能改善这种疗法的组合策略。

关键词：抗肿瘤免疫，癌症疫苗，细胞毒性T淋巴细胞，损伤相关分子模式，树突状细胞，光动力疗法，Toll样受体激动剂，肿瘤相关抗原

　

自理查德尼克松宣布“征服癌症成为全国性运动”以来，我们对癌症发展和传播的理解有了很大改善。由于对癌症研究和癌症预防的重大投资，治疗和生存在过去40年中有了显着改善[1]。因此，基础科学研究所创造的知识越来越多，逐渐转化为更多（有时更有效）的治疗方案[2]。尽管生物技术产生的药物越来越多，但在2008年，美国有50万人被诊断患有癌症[1]。

这些针对肿瘤相关因子（如配体，受体和转导信号因子）的药物中的一些是昂贵的，本质上不能用于广泛的癌症患者群体中，并且通常不能证明其优于常规化学治疗药物[3-6]。此外，用这种“单靶”药物治疗肿瘤给医生带来了其他问题。一些肿瘤仍然对治疗持续耐药，而其他肿瘤仅在晚期可检测到[7-9]。此外，一些肿瘤似乎适应这些专门的药物。每当他们的一部分生物途径被阻断时，他们通过开发替代生存途径来规避这些障碍。尽管存在已知的缺点，但包括手术，放射疗法和化学疗法在内的常规干预仍然是肿瘤学家用于治疗患者的工具箱中的第一选择。

　

光动力疗法（PDT）已被证明是几种适应症中三种所述治疗方式的有趣替代方法[10,11]。该技术基于通过局部或肠胃外途径向患者施用光敏剂。根据其药代动力学和药效学特性，本质上无毒的光敏剂（PS）选择性地积聚在肿瘤细胞和相关的（形态学改变的）脉管系统中（图1）。用适当波长的光激活导致PS从其电子基态（S0）激活到其激发态（Sn）之一。在生物介质中，激发的PS然后通过内部转换返回其最低激发态（S1）。从那里，它可以通过散热，荧光发射或通过自旋禁止的系统间穿越（ISC）转换到其最低三重态来返回其基态。这种长寿三重态可以通过荧光的发射或通过碰撞能量转移与其直接环境的能量交换而失去其能量。在存在分子氧的情况下，3O2转化为高反应性的1O2，这反过来又产生活性氧物质，最终破坏近距离的重要细胞靶标[12]。重要的是，只有PDT中所有三种成分（氧气、光敏剂和光）的伴随存在才会产生显着的光动力作用。因此，即使在目标组织中PS选择性较低的情况下，PDT的选择性也可以通过其他两种成分之一的存在/不存在来控制。

　

图1
光动力疗法的抗肿瘤机制
Jablonski图说明了光敏剂基态吸收光以形成短暂的激发单重态，其可以通过荧光损失能量，内部转化为热，或者可以经历系统间交叉到可以进行光化学的长寿命PS三重态。随后，该光化学导致局部产生对肿瘤和内皮细胞具有细胞毒性的活性氧物质。

HSP：热休克蛋白; hv：光; ISC：系统间交叉; PDT：光动力疗法; S0：基态; S1：第一激发单线态; S2：第二激发单线态; T1：第一激发三重态。

与常规治疗方式相比，光动力疗法具有几个优点。除了上述选择性外，它可以重复几次，副作用很少，与生物技术产品相比相对便宜，并且在极少数情况下仅报告了对这种治疗的耐药性[13,14]。迄今为止，已有几种PS可商购获得，其中一些PS被批准用于肿瘤适应症的治疗。大多数这些上市的PS属于化学类卟啉，二氢卟酚或其前体（图2）[15]。自其早期开始以来，PDT取得了实质性进展。长期的皮肤光敏化是一个基本上阻碍PDT广泛实施的问题，已经通过第二代PS的开发几乎被消除[16]。此外，这些化合物在可见光谱区域吸收，最适合深层组织穿透，并且制药科学已经解决了大多数亲脂性PS制剂遇到的问题[17]。然而，PDT尚未成为大多数适应症的一线治疗，可能是由于缺乏大型随机临床试验。此外，可以用次优的PDT参数观察到严重的副作用，例如PDT方案，PS和光剂量，尤其是在中空器官中。

　

图2
临床批准用于光动力疗法的光敏剂
5-ALA：5-氨基乙酰丙酸; BPD-MA：苯并卟啉衍生物一元酸环A; HP：血卟啉; mTHPC：间 - 四羟基苯基氯。

在体内，来自光动力学损伤的治愈性或缓解性效应可归因于几种，有时相互关联的生物学和生理学效应（图1）。取决于生物体和靶细胞内PS的定位，其浓度以及施用的轻剂量，PDT可通过直接细胞杀伤，肿瘤相关脉管系统的闭塞或免疫系统的调节发挥其作用。在细胞水平上，已经观察到坏死和凋亡是对光动力学损伤的主要反应[11,18-21]。最近，据报道自噬似乎在PDT中发挥作用[22,23]。

以前，人们认为PDT引起的损伤局限于照射区域。然而，在1941年，Blum假设所谓的扩张器物质的存在导致由于“组胺样”或H-物质的释放导致的微小脉管系统的渗透性增加[24]。实际上，现在已经认识到肿瘤细胞的直接损伤启动了几种细胞信号级联的启动。此外，内皮细胞（EC）的损伤和损伤将最终导致血栓形成并最终导致血管闭塞。在这两种情况下，都会触发细胞碎片，细胞因子和炎症介质的释放。反过来，这种反应激活了宿主反应元件的多方面反应，包括炎症和先天或适应性免疫。这两个事件对于明显的全身效应和PDT后的治疗结果至关重要。在本文中，我们将总结PDT如何刺激免疫系统。还将描述PDT对免疫系统的关键参与者的早期和晚期影响以及对局部和全身水平的肿瘤的影响。

　

PDT和抗肿瘤免疫反应
理想的癌症治疗方式应引起局部肿瘤消退和根除，以及诱导全身性抗肿瘤免疫，可有效根除远处转移，而不会对正常组织产生毒性。 PDT可能满足这些期望，因为它产生急性炎症并吸引免疫细胞治疗远处肿瘤。 PDT处理的垂死细胞产生危险信号，其既增加树突细胞（DC）的抗原呈递，又增加抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的募集。然而，这种对治疗的有利反应可能受到肿瘤所采用的免疫逃逸机制的损害，特别是通过瘤内积累T调节细胞（Tregs）[25]。因此，至关重要的是，我们了解控制PDT诱导的抗肿瘤免疫的机制能够成功地利用这种现象为癌症患者带来益处。

过去20年的专注研究为PDT介导的抗肿瘤免疫反应提供了一些启示，我们对这些过程的理解从未如此强烈。在下一节中，我们将回顾该领域的重要工作。

与损伤相关的分子模式
研究人员最近发现了第二组分子基序，它们可能与病原体相关分子模式（PAMPs）的作用类似。这些分子与宿主组织损伤相关，而不是与致病微生物相关。与用于PAMP的术语类比，第二类免疫系统的早期预警信号被命名为与损伤相关的分子模式（DAMPs）[26-28]。 DAMP是通常“隐藏”在活细胞内的细胞内分子，其通过突然和不受控制的受损和/或垂死细胞的诱导而获得各种不同的性质，例如暴露或分泌时的免疫刺激。 DAMP被认为介导垂死细胞可能的免疫原性。有人提出疏水性可能是最能激活先天免疫系统的“古老”危险信号，因此大多数已知的DAMP倾向于含有许多疏水区域，如属于热休克蛋白（HSP）家族的分子伴侣[29]。 ]。报告的DAMP列表见表1。

表格1
与光动力学治疗肿瘤后可能释放的损伤相关的分子模式分子。

DAMP：与损伤相关的分子模式; ER：内质网; HSP：热休克蛋白; PDT：光动力疗法。

DAMPs的发现可以解释一些关于肿瘤细胞是否已经被凋亡或坏死细胞死亡途径杀死是免疫原性的相互矛盾的报道[30]。虽然通常认为坏死的肿瘤细胞是促炎性的并且因此可能是免疫原性的，但是在癌症的PDT的情况下，尚未具体证明坏死性肿瘤细胞死亡对于产生免疫应答的重要性。据认为，一般的凋亡细胞和特别是被细胞凋亡杀死的肿瘤细胞以非炎症方式被巨噬细胞和其他吞噬细胞静默处理，因此不太可能刺激抗肿瘤免疫[31,32]。 。然而，其他报道表明，在某些情况下，凋亡的肿瘤细胞可能有效产生免疫反应[33,34]。最近，研究人员开始提到免疫原性和非免疫原性细胞凋亡[32,35,36]。

　

已知作为胚胎发生的一个主要方面的程序性细胞死亡的最初概念可能是非炎性和非免疫原性的，但是某些形式的癌症治疗导致肿瘤损伤（通过某些化学治疗剂或通过PDT方案）产生炎症并因此产生免疫原性形式的细胞凋亡，其主要特征在于DAMPS的释放。

虽然目前还没有很多研究广泛关注PDT后DAMP的释放，但该研究已开始研究[27,28]。最常报道的PDT后DAMP表达的例子是HSP向细胞膜的上调和易位[37,38]。

先天性免疫反应参与抗肿瘤PDT
先天免疫系统由缺乏免疫记忆的所有免疫防御组成。因此，先天反应的特征是它们保持不变，而不管抗原遇到的频率如何。先天免疫系统由几个免疫细胞组成，所有免疫细胞都是第一道防线[39]，PDT已被证明可以有效地使它们参与宿主对癌症的炎症反应[40,41]。 PDT通过刺激来自PDT治疗部位的各种促炎和急性期反应介质的释放或表达来改变肿瘤微环境（图3）。它们包括补体蛋白，HSP，花生四烯酸衍生物，趋化因子和细胞因子，如TNF-α，IL-6和IL-1 [42]。据认为PDT通过引起氧化应激的显着升高而在治疗的实体瘤中引起这种炎症反应，从而严重损害细胞膜和细胞质结构。身体认识到存在威胁受影响部位完整性的局部创伤，并释放促炎介质以维持体内平衡[43]。因此，PDT促使强烈的急性炎症反应，在治疗部位大量引起补体活化和中性粒细胞和其他炎性细胞的积累，并攻击肿瘤细胞[44,45]。特别是，补体系统已成为PDT对肿瘤细胞作用的有力介质，体外研究表明PDT可诱导补体C3蛋白固定于肿瘤细胞[46]。反过来，补体固定将细胞标记为先天免疫系统破坏的目标[47-49]。补体不仅可以作为炎症的直接介导，还可以刺激细胞释放继发性炎症介质，包括细胞因子IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-10，粒细胞集落刺激因子，血栓素，前列腺素，白三烯，组胺和凝血因子[50]。

图3
肿瘤的光动力疗法导致由局部释放的危险信号，细胞因子和花生四烯酸衍生物介导的局部炎症的发展
随后是免疫系统的各种细胞对治疗区域的浸润。

EC：内皮细胞; HSP：热休克蛋白; hv：光; PMN：多形核中性粒细胞; TBX：血栓烷。


除了刺激局部炎症外，PDT还可以全身作用，诱导强效的急性期反应[45]。使用经受PDT的动物肿瘤模型，研究人员观察到已建立的急性期反应物的血清水平显着升高，包括血清淀粉样蛋白P成分和甘露糖结合凝集素A.还注意到编码C-反应蛋白的基因的上调[51]。此外，急性期反应通过加速骨髓中性粒细胞的成熟以及增加储存库中性粒细胞的募集来引起显着的中性粒细胞增多[50]。在下一节中，我们将详细讨论几类免疫细胞在PDT抗肿瘤反应中的作用。

PDT和巨噬细胞
巨噬细胞是源自血源性单核细胞的吞噬细胞，已知其表达广泛的膜细胞受体，可识别许多内源性和外源性配体[52]。此外，巨噬细胞具有抗体和补体的受体，因此用抗体，补体或两者涂覆微生物可增强吞噬作用。随后的反应对于它们在体内平衡以及宿主防御中的功能至关重要，它们可以直接对肿瘤细胞具有细胞毒性，并通过呈递肿瘤抗原（TA）参与适应性免疫的激活。

有基于体外数据的报道，PDT可对单核细胞/巨噬细胞细胞谱系产生影响。巨噬细胞可通过低亚致死剂量的PDT激活[53]并通过PDT相关的巨噬细胞激活因子的增加来分泌TNF-α[54] [55,56]。有证据表明，巨噬细胞对亚致死剂量的PDT治疗的肿瘤细胞具有优先细胞毒性[57]，这种效应可能是由于巨噬细胞与自然杀伤细胞（NK）之间的潜在相互作用[58]。巨噬细胞功能也可以通过几种细胞因子增强，并且当Krosl等人。反复注射经致死照射的鳞状细胞癌（SCC）VII细胞进行基因工程以产生粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），他们观察到肿瘤相关巨噬细胞对PDT治疗的肿瘤具有更高的细胞毒活性[59]。

　

PDT和中性粒细胞
粒细胞是另一组形成先天免疫系统的细胞。这组细胞由嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞组成[60]。与巨噬细胞相反，它们只是微弱的吞噬细胞，它们的主要功能是分泌白三烯，前列腺素和其他细胞因子，以促进炎症反应的发展。中性粒细胞及其反应可能是“PDT和免疫学”领域研究最多的受试者。

Gollnick等人。证明2- [1-己氧基乙基] -2-二乙烯基焦脱镁叶绿酸-α（HPPH）介导的PDT由于趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2表达的瞬时和局部增加而导致中性粒细胞迁移到治疗的肿瘤区域（ IL-8的小鼠等同物，以及粘附分子E-选择蛋白的表达增加[42]。有趣的是，他们还发现IL-6表达的局部和全身性增加对于中性粒细胞募集不是必需的。随后的一份报告比较了低和高注量率（总光能量），每种注量均以低和高注量率对用HPPH治疗的Colo 26鼠肿瘤进行了比较[61]。高通量的保氧低通量率PDT产生70-80％的肿瘤治愈，而在耗氧高通量率下相同的通量产生10-15％的肿瘤治愈（The oxygen-conserving low fluence rate PDT at a high fluence yielded 70–80% tumor cures, whereas the same fluence at the oxygen-depleting high fluence rate yielded 10–15% tumor cures. ）。测量最高水平的炎性细胞因子和中性粒细胞浸润物，以低注量率（10-20％固化）递送低通量，而最佳治愈性PDT方案（低注量率时的高通量）产生最小的炎症。有趣的是，中性粒细胞的消耗并未显着改变该方案的高治愈率，但在最大炎症方案中废除了可治愈性。该小组随后证实，中性粒细胞归巢至外周组织（CXCR2（ - / - ）小鼠）或中性粒细胞耗尽的小鼠缺陷的小鼠在PDT后无法产生强烈的抗肿瘤CD8 + T细胞反应[62]。缺乏中性粒细胞似乎扰乱了T细胞增殖和/或存活，这些结果进一步支持了肿瘤浸润性中性粒细胞在PDT后建立抗肿瘤免疫中起重要作用的观点。 Sluiter等。首先观察到体内PDT后中性粒细胞粘附于微血管壁[63]，并且EC在PDT后收缩，允许中性粒细胞通过β2-整联蛋白粘附受体粘附到内皮下基质[64]。与该发现一致的是一份报告，描述了PDT后ECs上粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达水平下调[65]。在携带横纹肌肉瘤的大鼠中施用抗中性粒细胞血清和PDT完全消除了预期的抗肿瘤PDT效应，提供了额外的信息，即PDT治疗区域的中性粒细胞浸润对于有效的抗肿瘤反应是必需的[66]。用单克隆抗体阻断ICAM-1也减少了肿瘤治愈的次数，并且由中性粒细胞表达的ICAM1配体CD11b / c的显着上调也与PDT治疗的肿瘤相关[67]。在PDT治疗后4小时也发现外周血中性粒细胞数量增加并持续24小时。之前是血清IL-1β水平升高。抗G-CSF抗体降低中性粒细胞数量并降低PDT的功效。 Krosl及其同事研究了用Photofrin®PDT（Axcan Pharma，AL，USA）治疗的小鼠SCCVII模型中的细胞浸润[44]。他们报告中性粒细胞增加了200倍。 Cecic等人在患有SCCVII或EMT6乳腺癌的小鼠PDT（Photofrin或间 - 四羟基苯基氯）后建立了显着且快速的中性白细胞增多，并发现补体抑制完全阻止了这种[68]。 de Bruijn等发表了一项研究，其中用5-氨基乙酰丙酸-PDT治疗大鼠横纹肌肉瘤肿瘤在照射后的最初几天导致血液中性粒细胞显着增加，在治疗后16和24小时观察到最高水平[69] 。

PDT和NK细胞募集
在最近的一份报告中，Kabingu等人在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中使用NK细胞耗竭来评估该细胞谱系参与PDT诱导的免疫[70]。用EMT / 6肿瘤细胞同时皮下和静脉内注射小鼠以建立肺和皮下肿瘤;仅皮下肿瘤接受PDT治疗。他们观察到PDT后10天每只小鼠的肺肿瘤数量在NK耗竭的动物中显着更高，这表明NK细胞参与PDT诱导的肿瘤免疫控制。此外，在没有NK细胞的情况下，补充CD8 + T细胞的SCID小鼠表现出肺肿瘤数量的显着增加。作者得出结论，NK细胞可能在CD8 + T细胞的PDT后活性和远处未治疗转移的控制中起重要作用。
　

PDT和DC
树突细胞是最有效的APC并且是抗肿瘤免疫应答发展的关键因素。 DC有两种成熟的成熟状态，包括“不成熟”和“成熟”状态[71]。 “成熟”的决定受到来自环境的信号的极大影响。在许多情况下，肿瘤微环境不仅不能提供有效DC激活所需的促炎信号，而且还提供了主动抑制它的额外免疫抑制机制。这些因素影响DC的分化，导致功能正常的成熟APC水平降低，以及未成熟树突细胞的积累[72]。未成熟的DC是那些不断地对其环境进行采样，捕获抗原并以少量迁移至引流淋巴结的DC。它们显示出反映其作为抗原捕获细胞的特殊功能的表型。它们是高度内吞的，能够通过巨胞饮作用获得液相抗原，通过受体介导的内吞作用摄取蛋白质或抗原 - 抗体免疫复合物，并通过吞噬作用摄取整个细胞。它们表达相对低水平的表面MHCI和MHCII基因产物和共刺激分子如CD80和CD86。

在没有炎症的情况下，DC保持未成熟状态，并且抗原呈递给淋巴结中的T细胞而没有共刺激，导致T细胞的缺失或诱导型Treg的产生。组织炎症诱导DC的成熟和大量成熟DC迁移至引流淋巴结。成熟的DC在细胞表面表达肽-MHC复合物，以及合适的共刺激分子。这允许启动CD4 + T辅助细胞和CD8 + CTL，激活B细胞和启动适应性免疫应答。

　

已经很快意识到DC可能在PDT介导的抗肿瘤免疫中起重要作用。由PDT诱导并从肿瘤细胞释放的主要细胞因子之一是细胞外HSP70。 HSP70的表达是由细胞应激引起的，当HSP保持在细胞内时，它会伴随未折叠蛋白，并通过阻止细胞蛋白的聚集来抑制细胞死亡[73]。这与细胞质TA形成稳定的复合物，然后可以在细胞膜表面展示或者从死亡的坏死细胞中完整地逃逸，以与诸如DC的APC相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答[37]。 DC和其他APC在其表面上具有高亲和力受体，并且HSP-抗原复合物的结合导致DC的有效活化和成熟以及随后将肽抗原呈递给CD8 +细胞毒性T细胞[74]。由三种不同的PS介导的PDT已经显示出增加HSP70 mRNA，但是只有单-l-天冬氨酰二氢卟吩-e6和锡etiopurpurin，而不是Photofrin，在体外和体内肿瘤中增加小鼠肿瘤细胞中的HSP70蛋白水平[38]。 因此，可以容易地被来自PDT诱导的坏死肿瘤细胞的DC摄取的HSP结合的TA的释放可以解释PDT刺激针对肿瘤的免疫应答的特定效率。还观察到PDT产生的裂解物能够诱导表型DC成熟和IL-12表达。 Korbelik和Sun通过用苯并卟啉衍生物（BPD）-PDT处理SCCVII细胞并随后用致死的X射线剂量产生疫苗，并且显示这些细胞在已经建立的SCCVII肿瘤的小鼠中肿瘤周围注射时产生显着的治疗效果，包括生长迟缓，肿瘤消退和治愈[75]。重要的是，在注射后1小时从治疗部位取回的疫苗细胞与DC混合，在其表面上显示HSP70，并通过补体C3调理。

　

PDT和适应性免疫
适应性免疫由抗原特异性B和T细胞提供。 B细胞产生免疫球蛋白，抗原特异性抗体负责消除细胞外微生物。 T细胞被分成几个群体，它们可以参与帮助B细胞产生抗体或根除细胞内病原体，激活巨噬细胞，杀死病毒感染或癌细胞，最后免疫抑制。 PDT中适应性免疫系统的参与如图4所示。

图4
光动力疗法引起的局部炎症导致全身免疫的发展
从PDT处理的肿瘤细胞释放的抗原被DC吞噬并呈递给区域淋巴结中的幼稚T细胞。活化的T细胞返回循环，然后追踪并摧毁肿瘤。 BCG：Bacillus Calmette-Guérin; C.P。：Corynebacterium parvum; DC：树突状细胞; G-CSF：粒细胞集落刺激因子; GM-CSF：粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子; hv：光; MCWE：分枝杆菌细胞壁提取物; PDT：光动力疗法; SPG：Schizophylan。


PDT激活CD8 + T细胞
有关细胞毒性T细胞参与PDT抗肿瘤作用的第一个证据来自Canti及其同事[76]，他们研究了PDT对免疫抑制和携带MS-2纤维肉瘤的正常小鼠的影响。所有小鼠都被治愈并无限期存活，但是对于通过PDT治愈的正常存活动物，对MS-2再攻击的抗性是明显的，而免疫抑制的存活动物和通过手术治愈的动物在肿瘤再激发后死亡。不同的同系小鼠白血病未被拒绝。随后在PDT之前进行的将幼稚BALB / c小鼠的脾T淋巴细胞过继转移到SCID小鼠中的研究提供了额外的证据。它推迟了治疗肿瘤的复发，而立即或PDT后7天进行的过继转移没有任何益处[77]。在5周前通过PDT治愈EMT6的正常小鼠的非粘附脾细胞（CD4 +和CD8 + T细胞的混合物以及一些B细胞，NK细胞和单核细胞）的过继转移完全恢复了PDT对SCID小鼠中生长的EMT6肿瘤的疗效。从通过X射线固化的供体获得的脾细胞效果差得多。其他研究使用耗尽来证明细胞毒性T细胞的作用。来自供体脾细胞的特定T细胞群的消耗表明CD8 + CTL具有最大的作用，而CD4 +辅助T细胞起支持作用[78]。使用PDT与PS 2 - 碘-5-乙基氨基-9-二乙基氨基苯并吩噻嗪氯化物[79]进行了类似的研究。

　

PDT和CD4 + T细胞
Gollnick等人表明CD4 + T细胞耗竭对PDT控制治疗区外肿瘤的能力没有影响[70]。在CD4 + T细胞耗尽后转移至SCID小鼠的脾细胞成功地控制了肿瘤的生长，并且在缺乏CD40的小鼠中也证实了这些观察结果，CD40是与DC相互作用所必需的CD4 + T细胞共刺激分子。与野生型小鼠相比，PDT后的肿瘤生长控制没有显着差异。为了进一步阐明CD4 + T细胞对PDT诱导的免疫的必要性，他们仅用CD8 +细胞重建SCID小鼠，然后用EMT / 6肿瘤接种它们。随后的PDT治疗导致40天的无肿瘤存活，并且通过静脉内施用相同肿瘤的再次攻击的排斥来证明记忆免疫的发展。


PDT和TA（肿瘤抗原）
免疫系统可以解决肿瘤的机制是通过识别MHC I类分子在肿瘤细胞表面上呈现的TA以及随后通过CTL破坏这些肿瘤细胞。许多这些TA的分子特性已在小鼠和人类肿瘤中得到很好的定义[80]。迄今为止定义的TA大致属于三大类：

由黑色素瘤抗原（MAGE）型癌症 - 睾丸基因编码的抗原在各种肿瘤中表达但在正常组织中不表达，例如小鼠基因P1A和MAGE，B黑素瘤抗原（BAGE）和G抗原（GAGE）的人类基因家族[81-86]。这些抗原是肿瘤特异性的，并且在大多数正常成体细胞中不存在。如果它们存在于正常组织中，它们通常在免疫特权位点如睾丸中表达，因此不会暴露于宿主免疫系统。它们也是共享的，因为它们存在于许多组织学类型的肿瘤中;

黑素细胞谱系的分化抗原，存在于大多数黑素瘤上，但也存在于正常黑素细胞上[86-88];

由基因中肿瘤特异性突变引起的抗原，在所有组织中均有表达[89-93]。在大多数情况下，突变对于单个肿瘤是独特的，因此这些抗原是个体特异性的。

已经努力将确定的TA引入小鼠肿瘤细胞系中以具有可重复的模型进行研究。这些通常是“外来的”蛋白质，如来自细菌的β-半乳糖苷酶[94]，来自鸡蛋的卵清蛋白[95]和病毒性流感血凝素[96]等。对于许多这些TA，MHC-1分子中显示的肽序列是已知的，并且已经产生了杀死表达这些TA的肿瘤细胞的特异性CTL系。无论这种方法成功在实验室中是否成功，人工TA在临床上都不适用，并且优选研究天然存在的TA。因此，我们建议通过使用两种天然存在的癌症抗原在更临床相关的环境中研究抗原特异性PDT诱导的抗肿瘤免疫应答：小鼠MAGE型P1A抗原，最好描述的未突变小鼠癌/睾丸肿瘤抗原已经鉴定[81,97,98]，并且E7抗原与人乳头瘤病毒诱导的宫颈癌相关[99]。

我们的实验室是第一个认识到TAs在PDT后抗肿瘤免疫反应中的作用的实验室。我们发现血管PDT方案能够通过逆转录病毒载体转导稳定表达增强型绿色荧光蛋白的RIF1细胞在C3H小鼠中形成肿瘤时能够产生100％的长期治愈和再次攻击的排斥[100]。最近完成的研究更进一步，并表明PDT可以诱导高效的抗原特异性全身免疫反应，能够导致远处确定的肿瘤消退[101]。

关于TA在PDT免疫应答中的作用的其他信息来自其他实验室。 Abdel-Hady等人的报告观察到三分之一的高级别外阴上皮内瘤变（VIN 2-3）患者接受5-氨基乙酰丙酸PDT治疗后的短期反应[102]。在这项研究中，Abdel-Hady研究了人类乳头状瘤病毒感染的水平，HLA表达水平以及免疫系统细胞在来自应答者和无应答者的活组织检查中对病变的浸润。有趣的是，无应答者更可能显示HLA I类丢失，而应答者显示CD4 +和CD8 + CTL的浸润增加。这些数据间接地指出了肿瘤抗原呈递在抗肿瘤PDT免疫中的作用。

　

最近，已经在临床环境中研究了肿瘤抗原（TA)在PDT抗肿瘤免疫中的作用。在Kabingu等人的研究中，基底细胞癌病变用PDT治疗或手术切除，结果显示hedgehog相互作用蛋白1的免疫识别，TA在某些基底细胞癌病变患者中增加，在接受PDT治疗的患者中显着更好[103]。这些研究结果表明，局部肿瘤PDT可以增强患者对肿瘤抗原的系统免疫反应，并有助于验证以前的临床前研究结果。


PDT和Tregs
CD4 + T细胞中的特殊群体是Tregs。 Tregs可定义为功能性抑制免疫应答的T细胞群。 Tregs最初由Gershon等人描述。在20世纪70年代早期，被称为抑制性T细胞[104]。最近人们对Tregs在小鼠和人类中的作用产生了浓厚的兴趣，导致许多研究描述了他们参与自身免疫性疾病[105]和癌症[106]。 Tregs最初的特征是共表达CD4和高水平的CD25（IL-2R复合物的高亲和力成分[IL-2Rα-链]）[107]。随后确定Tregs的最特异性标记物是转录因子Foxp3 [108]，因为其他T细胞标记物（CD25，CTLA-4和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体[GITR]）可以在其他T细胞上找到子集，尤其是激活的CD4 + T细胞[109,110]。转录因子Foxp3在Tregs中特异性表达，是其发育所必需的[111]。 CD25 + Treg包含5-10％的CD4 + T细胞，并且分为两大类：胸腺中发现的天然存在的Tregs和外周发现的诱导型Tregs [112]。天然存在的Tregs被认为具有T细胞受体（TCR），其识别自身抗原并在预防自身免疫疾病中起主要作用。诱导性Treg可以在外周诱导和分化，例如在肿瘤微环境中。肿瘤微环境中的胸腺衍生的Treg可能在肿瘤相关DC刺激后克隆性扩增，所述DC通常具有不成熟的表型。由于在TGF-β的影响下CD4 + CD25-T细胞转化，Treg也可能存在于肿瘤中，TGF-β在肿瘤微环境中以高水平存在[114]。因此，肿瘤（或肿瘤引流淋巴结）可能含有胸腺来源的天然Tregs，扩增和转化的天然Tregs，以及局部分化和扩增的T诱导型调节型1细胞。

　

据认为，Tregs通过多种途径介导其免疫抑制作用[115]。 Tregs表达CTLA-4，它与APC上的B7-1和B7-2共刺激分子结合，但亲和力远高于CD28，并产生阴性信号，而不是正常T细胞上表达的等效分子CD28产生的阳性信号。 [116]。 T细胞活化是一个动态过程，由TCR信号的强度决定; CD28提供的共刺激的强度;以及CTLA-4产生的抑制信号的大小。 Tregs也表达GITR，然而，这似乎减少了结合其配体的抑制功能[117]。 Treg可以表达TGF-β，它是一种免疫抑制细胞因子[118]，可以诱导Tregs的进一步增殖[119]。最近的证据还表明，Tregs通过抑制DC激活来控制T细胞活化[120]。此外，成像研究表明，Tregs会降低DC与自身反应性T细胞形成稳定接触的能力，从而减少其活化[121]。

肿瘤诱导的Tregs扩增是成功的癌症免疫疗法的主要障碍。已经表明，Tregs抑制了针对肿瘤的免疫应答的产生[112]。许多研究报道，增加的肿瘤Tregs预测存活率降低或治疗反应降低。 Tregs通过多种途径介导其免疫抑制作用[115,116,118-120]，使用抗体[112]或环磷酰胺（CY）[122]靶向这些细胞可促进几种可移植小鼠肿瘤的排斥[123,124]，从而导致完全和永久性的消退已建立的肿瘤[125]或具有记忆表型的CD4 +和CD8 + T细胞的比例增加[126]。

我们的实验室是第一个意识到Tregs可能在PDT抗肿瘤免疫中发挥重要和消极作用的实验室。我们观察到，低剂量的环磷酰胺（CY）可以有效地消耗Tregs，并且低剂量CY与BPD-PDT结合导致大量长期J774网状细胞肉瘤治愈和对肿瘤再次攻击的抗性，而任一治疗单独导致从进行性肿瘤或转移中100％死亡[127]。固化的小鼠在脾脏中具有肿瘤特异性T细胞，并且显示低剂量CY显着减少Tregs的数量。我们最近的初步数据显示CY的Treg消耗可以解释结肠腺癌CT26WT模型中对小鼠自身抗原gp70的PDT介导的免疫应答[Mroz P等，未公开的数据]。此外，这种组合治疗导致长期免疫记忆的发展，这种免疫记忆只能在再次激发之前通过CY施用来揭示。

PDT和免疫刺激剂
由于PDT后可观察到的免疫反应的频率和一般不令人满意的性质，相当多的工作已经进入测试策略，旨在与PDT组合施用某种免疫刺激剂或佐剂以增加抗肿瘤的频率或强度。免疫反应。许多这些组合佐剂属于Toll样受体（TLR）激动剂的分类。 TLRs于1994年被发现，并以果蝇Drosophila melanogaster中的Toll基因命名，该果蝇负责免疫真菌感染，它通过激活抗菌肽的合成来实现[128]。现在已知大多数哺乳动物物种具有10至15种TLR，它们的作用是作为微生物入侵的早期预警系统[129]。来自革兰氏阳性菌（TLR-1，-2和-9），来自革兰氏阴性菌（TLR-4，-5和-9）和来自病毒（TLR-3，-7）的各种分子基序（PAMP）和-8）结合TLR，从而激活细胞信号通路，导致细胞因子的分泌，炎症级联的激活和先天免疫细胞的募集，这将破坏微生物入侵者[130]。由于这种激活免疫系统的能力，一些研究小组研究了将这些物质与PDT结合起来是否有益。由于大多数TLR激动剂的性质，它们不能全身给药，因为它们会由于全身内先天免疫细胞的不加选择的激活和细胞因子如TNF-α的不受控制的分泌而引起不可接受的毒性。由于这些原因，TLR激动剂和其它相关免疫刺激制剂的组合通常通过瘤内或肿瘤周围注射少量物质进行局部给药。这在图5中示意性地说明。表2列出了其中微生物制剂已成功与PDT组合的研究。

图5
通过有助于更好地激活树突细胞，巨噬细胞或中性粒细胞的策略可以强有力地增强先天免疫系统的局部活化。
瘤内注射大大提高了组合策略的有效性。

DC：树突状细胞; hv：光; PDT：光动力疗法。



表2
研究结合微生物产品的局部应用和肿瘤的光动力疗法。

ALA-PPIX：5-氨基乙酰丙酸 - 原卟啉IX; BCG：Bacillus Calmette-Guérin; BPD：苯并卟啉衍生物; HPV：人乳头瘤病毒; LLC：Lewis肺癌; MCWE：分枝杆菌细胞壁提取物; mTHPC：M-四羟基苯基氯; PDT：光动力疗法; SCC：鳞状细胞癌; ZnPc：锌酞菁。

除TLR激动剂外，其他微生物物质（尤其是来自真菌的微生物物质）可激活先天免疫系统的其他方面，如补体和C型凝集素[131,132]。已经与PDT组合的称为糖化壳聚糖[133]和裂褶多糖[134]的佐剂都可能被C型凝集素识别。另一方面，酵母多糖（也是真菌成分）与PDT结合时被认为可作为补体的经典激活剂[135]。


PDT和组合方法
已经有研究使用联合疗法通过影响免疫系统的各种元素来增加肿瘤对PDT的反应（参见表3的总结）。这些组合方法包括细胞因子，如TNF-α，Bellnier在单剂量静脉内给予重组人材料后显示，可增强光敏素介导的鼠SMT-F腺癌的PDT [136]。 Photofrin介导的PDT针对SCCVII肿瘤与血清维生素D3结合蛋白衍生的巨噬细胞活化因子组合进行测试[137]。

　

这显着改善了PDT的结果，但作为单一药剂对SCCVII肿瘤的生长没有显着影响。 G-CSF联合Photofrin介导的PDT局部肿瘤治疗导致肿瘤生长明显减少，携带两种类型肿瘤的BALB / c小鼠存活时间延长：colo 26肿瘤和Lewis肺癌[138] ]。此外，33％的colo 26荷瘤小鼠在联合治疗后完全治愈，并产生特异性和持久的免疫力。 Korbelik和Cooper使用病灶内γ-菊粉（一种有效的经典补体激活剂）来延缓PDT后B16BL6黑色素瘤的复发[139]。 IFN-γ预处理进一步增强了γ-菊粉的这种作用。在个体PDT或γ-菊粉处理后已经升高的肿瘤C3蛋白水平在它们组合后增加得更多。对于纤维肉瘤MCA205和FsaR，佐剂γ-菊粉被证明在使用四种不同的PS（BPD，ce6，Photofrin和间 - 四羟基苯基氯）的PDT后非常有效地降低复发率。在PDT加γ-菊粉处理后3天，在肿瘤部位发现的超过50％的细胞是通过穿孔素 - 颗粒酶途径杀死特定靶标的CTL。

表3
其他免疫刺激剂的研究已与肿瘤的光动力疗法相结合。

BPD：苯并卟啉衍生物; CT：结肠肿瘤; CY：环磷酰胺; DBPMAF：维生素D结合蛋白巨噬细胞活化因子; G-CSF：粒细胞集落刺激因子; GM-CSF：粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子; HPPH：2-（1-己氧基乙基）-2-脱乙酰基焦脱镁叶绿酸-a;腹腔注射;腹腔注射; iv。：静脉注射; LLC：Lewis肺癌; mTHPC：M-四羟基苯基氯; PDT：光动力疗法; SCC：鳞状细胞癌。


PDT诱导的免疫和癌症疫苗
如果抗菌疫苗可以被认为是21世纪的重大成就之一，那么可能减少或消除衰弱和致命恶性肿瘤的发病率和死亡率的癌症疫苗显示出成为下一代最大的利用[140]。最近的研究表明，PDT可用于生产此类癌症疫苗。 PDT衍生的抗癌疫苗具有临床潜力，可成为治疗各种癌症的有益佐剂或主要疗法。

　

传统疫苗接种背后的概念是引入减毒或杀死形式的微生物（或其毒素），身体识别为外来物并产生针对其的保护性抗体。研究人员制作了具有类似机制的癌症疫苗，将肿瘤细胞暴露于致命剂量的辐射，然后将这些杀死的肿瘤细胞引入动物受试者，希望宿主的免疫系统能够识别被杀死的肿瘤细胞并产生免疫力。然而，许多肿瘤细胞的免疫原性很差，因此不是基于疫苗的疗法的最佳靶标。然而，已经假定PDT可用于增强肿瘤细胞的免疫原性并增加抗癌疫苗的有效性。 Korbelik和Sun将SCC细胞与光敏剂BPD一起孵育并将它们暴露于光（690nm，1J / cm2），然后通过辐射暴露它们[75]。这些构成癌症疫苗的PDT处理的肿瘤细胞在携带皮下SCC的小鼠中肿瘤周围注射。 PDT疫苗产生了显着的治疗效果，包括肿瘤生长迟缓，消退和治愈。有趣的是，增加PDT疫苗中癌细胞的接种物进一步改善了结果，用2×107细胞/疫苗接种达到最大益处。每个接种物细胞的进一步增加证明适得其反并降低疫苗效力，可能是由于过量抗原负荷引起的宿主免疫反应的自我调节下调[141]。值得注意的是，在两种浓度的PS剂BPD之间没有发现显着差异，并且两种剂量同样有效。为了剖析造成观察现象的机制，Korbelik等人。接种疫苗后4天切除小鼠淋巴结，并注意到与对照组相比，PDT接种小鼠淋巴结细胞显着增加[75]。已经注意到T细胞增加了5到6倍，B细胞增加了17倍以上，DC增加了10倍以上。此外，更大百分比的T细胞具有CD44 + CD45RB-记忆表型。发现检索到的PDT疫苗肿瘤细胞被C3表面蛋白包被，淋巴结细胞也是如此。补体参与的相关性通过以下事实得到证实：PDT疫苗被认为在C3补体缺陷型小鼠中无效。还发现检索到的肿瘤细胞在其细胞表面上表达HSP70。 Gollnick等人还探讨了PDT疫苗在癌症治疗中的有效性[142]。他们将PDT疫苗潜力与紫外线辐射或电离辐射产生的疫苗进行了比较。 PDT产生的疫苗是肿瘤特异性的，诱导细胞毒性T细胞应答，并且与产生疫苗的其他方法不同，不需要共同给予佐剂以使其有效。此外，PDT产生的裂解物能够诱导表型DC成熟和IL-12表达。



专家的评论

现在人们普遍认为，PDT治疗癌症后，无论是在动物模型中还是在病人身上，免疫系统都有明显的激活。然而，在影响这种效应的分子和细胞决定因素上，以及更重要的是如何改善这种效应上，还没有达成一致。已经观察到T细胞反应(CD4和CD8)，这些反应被证明是肿瘤特异性的，并可导致记忆免疫。其他报道显示PDT后中性粒细胞、NK细胞和巨噬细胞的活化。有观点认为，急性炎症程度高的PDT方案比急性炎症程度低的PDT方案更有利于免疫激活。然而，可以想象的是，PDT诱导的炎症实际上可能会增加肿瘤细胞的复发率或再生。已知炎症介质的增加在许多情况下可以促进肿瘤细胞的生长[143]。急性期反应和补体活化被认为是PDT后免疫反应的重要途径。肿瘤已经进化出特定的途径和机制来逃避宿主的免疫反应，这一认识直到最近才被PDT领域所认识。将PDT和免疫刺激剂相结合的大量多样的治疗方法已经进行了测试，但是对于哪种方法是最好的以及哪种方法可以临床应用还没有一致的意见。

　

展望五年的观点
我们相信，未来5年将在PDT后的抗肿瘤免疫应答领域取得重大进展。这些进步将主要由三个因素驱动。首先，肿瘤免疫学界将更加了解肿瘤如何与宿主的免疫系统相互作用。将更好地理解肿瘤用于逃避宿主免疫应答和抑制免疫系统的不同途径，并且将发现克服这些途径的更有效方法。其次，PDT领域将取得进展。这些将包括更好的PS和改进的光源和光传递技术，这将使得在PDT治疗的肿瘤中获得良好的局部反应更加可预测和可实现。 PDT领域还将越来越多地研究免疫学方面，特别是在小动物肿瘤模型中。组合研究将继续增加。重要的是，PDT专家和肿瘤免疫学家之间需要进行更多的合作和讨论。第三，临床医生将更多地参与治疗癌症患者的PDT。我们只知道一篇临床论文证明了PDT后有效诱导适应性抗肿瘤免疫[144]。临床PDT试验将包括患者的一种或多种免疫功能和免疫反应测量，这些指标将与结果相关联。我们必须认识到，使用PDT诱导足够强大的抗肿瘤免疫反应，导致晚期癌症患者的生存率提高，成为临床上可接受的实践，这将花费相当长的5年时间。

　

Stimulation of anti-tumor immunity by photodynamic therapy
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3060712/