抗坏血酸增强三氧化二砷诱导的多发性骨髓瘤细胞毒性
Ascorbic acid enhances arsenic trioxide–induced cytotoxicity in multiple myeloma cells
多发性骨髓瘤（multiple myeloma)是一种以骨髓浆细胞生长缓慢为特征的克隆性B细胞恶性肿瘤。MM患者通常对初始化疗有反应;然而，从本质上讲，所有的进展都是向一种耐化学反应的状态发展的。导致化学分形表型的因素包括自由基清除的调节、药物外排泵表达的增加以及允许从凋亡信号中逃逸的基因表达的改变。近期研究表明，三氧化二砷(As2O3)可诱导难治性急性早幼粒细胞白血病的缓解和过表达Bcl-2家族成员的细胞凋亡;因此，推测化学可分型MM细胞对As2O3敏感。As2O3诱导4株人MM细胞凋亡:8226/S、8226/Dox40、U266、U266/Bcl-xL。白细胞介素-6的加入对细胞死亡没有影响。谷胱甘肽(GSH)被认为是一种抑制As2O3诱导的细胞死亡的抑制剂，无论是通过结合As2O3或通过隔离As2O3诱导的活性氧。与这种可能性相一致，增加谷胱甘肽水平与N -乙酰半胱氨酸减弱了As2O3的细胞毒性,谷胱甘肽的降低与抗坏血酸(AA)的代谢有关。临床相关剂量的AA降低了GSH水平，增强了As2o3介导的所有MM细胞系的细胞死亡。在新近分离的人类MM细胞中也得到了类似的结果。相比之下，正常的骨髓细胞对单独或与AA结合的As2O3几乎没有敏感性。总之，这些数据表明As2O3和AA可能是难治性MM的有效抗肿瘤药物,并且AA可能是GSH敏感治疗的有用辅助剂。
介绍
多发性骨髓瘤(MM)是一种无法治愈的B细胞恶性肿瘤，其特征是骨髓中的浆细胞浸润，生长缓慢，产生单克隆免疫球蛋白分子(Hallek et al1综述)。MM在所有癌症中占1%，在所有血液病中略高于10%，比何杰金氏病和急性白血病更常见。目前治疗MM的药物包括烷基化剂(melphalan)和类固醇(强的松，地塞米松)单独或联合其他抗肿瘤药物，包括植物生物碱(长春新碱，长春碱)和蒽环类药物(阿霉素)。.高剂量化疗联合自体或异基因干细胞移植已导致生存率的一些改善，和包括沙利度胺在内的一些较新的治疗方法正在研究中。然而，MM总是有一个咄咄逼人的过程;基本上，所有(90%以上)患者都进展到耐药或难治性状态。即使接受治疗，MM患者的5年平均生存率也低于25%。因此，难治性MM的治疗显然需要新的治疗方法。
至少有4种不同的机制有助于获得MM的化学耐受表型，必须克服或绕过这些表型才能有效治疗难治性疾病。细胞对类固醇的反应通常依赖于糖皮质激素受体的表达，而对类固醇治疗的耐药性通常与恶性浆细胞糖皮质激素受体表达下调或丢失有关。表达药物外排泵，如mdr基因产物p -糖蛋白(PgP)，也是耐药MM细胞的共同特征。难治性MM和耐药细胞系患者的8-10个浆细胞过表达PgP。然而，在临床上，用钙通道阻滞剂如维拉帕米或环孢霉素类似物克服PgP的努力取得了令人失望的结果。除了限制抗肿瘤药物对药物靶点的使用外，还选择了具有抵抗药物作用机制的耐化学反应细胞。人们普遍认为，许多种类的化疗药物，包括用于治疗MM的药物，都集中在凋亡通路上杀死肿瘤细胞。与这种作用模式一致，细胞凋亡阈值的变化与许多实体肿瘤、白血病和淋巴瘤的耐药或晚期疾病有关。近年来，有报道称抗凋亡蛋白Bcl-xL在耐药MM细胞系和难治性MM患者中表达较高。此外,有充分的的证据表明白细胞介素- 6 (il - 6)、旁分泌或自分泌的方式,在MM的恶性发展中扮演着重要的角色通过调节MM细胞的生长和存活。最后，据报道，耐化学反应的MM细胞比药物敏感细胞更有效地代谢抗肿瘤药物。例如，在MM细胞中谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽相关酶的表达或活性分别增加，对烷基化剂(如melphalan)产生抗性。对化学可分型MM的有效治疗必须克服或绕过药物外溢泵的表达、IL-6的增殖和存活信号、抗凋亡蛋白(如Bcl-xL)水平的升高以及谷胱甘肽表达的增加。
最近有数据显示，化学可分型急性早幼粒细胞白血病患者对三氧化二砷(As2O3)治疗有反应，针对这一数据，已有19项研究开始评估As2O3在其他疾病中的治疗潜力。关于As2O3在白血病和淋巴细胞中的作用的机制研究表明，抗肿瘤活性克服了Bcl-2或Bcl-xL的表达。此外，不共轭的As2O3不大可能成为药物射流泵的底物。因此，即使在Bcl-xL表达水平升高的pgp阳性浆细胞中，As2O3也可能是一种有前途的MM抗肿瘤药物。然而，细胞对As2O3敏感性的主要决定因素似乎是细胞内的谷胱甘肽水平，和升高的谷胱甘肽水平与MM的化学耐受性表型有关。因此，对耐药MM的最佳治疗也应该克服或绕过GSH表达的增加。降低细胞内谷胱甘肽水平的化合物可能增加化学可分解MM细胞对As2O3的敏感性。尽管现有的GSH耗竭化合物如乙丙烯酸和丁硫氨酸磺酰亚胺具有治疗潜力，但毒性限制了其广泛使用。因此，必须研究能够安全降低谷胱甘肽水平的新制剂;抗坏血酸(AA)是一种很有前途的候选药物，被广泛认为是一种抗氧化剂。然而，越来越多的证据表明AA也可以作为氧化剂，特别是在存在增加活性氧(ROS)产生的化合物的情况下。AA的促氧化作用和自由基诱导的细胞死亡的增强作用似乎与过氧化氢(H2O2)的产生有关。
这些数据让我们假设As2O3和AA的结合可能是一个对化疗难治性MM的治疗。与发现谷胱甘肽水平决定As2O3敏感性一致, 我们发现NAC减轻As2O3介导的MM细胞系的细胞死亡。利用化学敏感性和化学可分形MM体外模型，我们证明AA耗尽了细胞内的谷胱甘肽，增加了过氧化氢的产生，并增强了As2O3的细胞毒性。值得注意的是，AA还增加了从骨髓中分离出的As2O3诱导的非浆细胞群体中毒性较小的MM患者浆细胞的死亡。
材料和方法
试剂和细胞系
前面已经描述了8226/S、8226/Dox40、8 10和u26639细胞株。U266/Bcl-xL在其他地方有更详细的描述(Oshiro等人，提交了手稿)。As2O3、AA、碘化丙钠(PI)、依泊苷、紫杉醇、staurosporine、偏磷酸购自Sigma Chemical (St . Louis, MO);NAC和doxorubicin (Dox)购自Bedford Laboratories (Bedford, OH)。
膜联蛋白v -荧光素异硫氰酸酯和碘化丙钠染色
用Annexin v -荧光素异硫氰酸酯(FITC) (Biovision, Palo Alto, CA)和PI染色检测细胞活力。细胞(2.5×105)对待As2O3表示浓度(1 - 100μM剂量反应实验;2μM其他实验),南京(10μM), AA(100μM),依托泊苷(10μg /毫升),紫杉醇(0.5μM), staurosporine(0.5μM),和阿霉素(200海里)。细胞的il - 6研究使用il - 6(前1小时100 ng / mL)的As2O3(2μM)。指定的时间后,细胞被洗一次磷酸盐PBS和沾膜联蛋白V-FITC (Biovision)和π(2μg /毫升)根据制造商的指示。使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson, San Jose, CA)采集样本，使用Cellquest软件(Becton Dickinson)进行分析。
测量细胞内谷胱甘肽(GSH)
细胞内谷胱甘肽水平测定在细胞系和单核细胞从BM吸入。从同意的MM患者中提取BM，通过菲科尔梯度纯化分离单核细胞。将BM抽吸液(约15 mL)与预热的PBS(37°C) 1:1稀释，并覆盖于预热的ficol - hypaque(瑞典乌普萨拉的Amersham)上。室温下2000转/分离心20分钟后，取出单核细胞(包括浆细胞)，PBS洗净，血球计计数，电镀。细胞(4×106)治疗48小时与AA(100μM),并使用谷胱甘肽测定细胞内谷胱甘肽测定工具包(Calbiochem,圣地亚哥,CA)。短暂,细胞颗粒状,resuspended偏磷酸μL冰冷的5%,500年和均质聚四氟乙烯杵(惠顿、Millville新泽西)和开销搅拌器。在4°C和3000 g离心后10分钟,200μL上层清液,700μL缓冲区,50μL解R1, R2和50μL解决方案是结合根据制造商的指示。样品在室温下黑暗中孵育10分钟，在400nm处测定最终吸光度，并与GSH标准曲线进行比较。为了定量总蛋白，将上述离心得到的颗粒重悬于1n NaOH中，采用Bio-Rad DC protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA)测定蛋白浓度。细胞内谷胱甘肽被归一化为总蛋白含量。
测定H2O2的生成
H2O2的产生是用H2DCFDA(分子探针，Eugene, OR)，一种H2O2敏感的荧光染料来测量的。简单,细胞(2×105)孵化的存在与否AA(100μM) 24小时。在过去的30分钟的孵化时间,H2DCFDA(0.5μM)被添加到细胞培养。细胞在PBS中洗涤，在FACS缓冲液(1% BSA和0.01%叠氮化钠PBS)中复苏，流式细胞术分析。
超氧化物生产的测定
通过测定氢乙啶(分子探针)向乙二胺的转化，确定了超氧化物的产生。简单,细胞(2×105)孵化的存在与否As2O3(2μM)有或没有AA(100μM) 24小时。细胞在PBS中洗涤，1ml PBS中复苏，置于冰上。Hydroethidine原液(2毫米)在PBS稀释(25μL Hydroethidine股票为5毫升PBS)和添加(250μL)每个样本。立即对样品进行涡旋，在37℃的黑暗中孵育20分钟。孵育后，细胞置于冰中，避光，10分钟内流式细胞术分析。
线粒体膜电位流式细胞术分析
采用阳离子亲脂染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE;分子探针)。细胞(2×105)孵化的存在与否As2O3(2μM)±AA(100μM) 48小时。细胞PBS洗涤，加入TMRE (150nm)的FACS缓冲液中复苏，37℃黑暗中孵育20分钟。PBS加TMRE (15nm)洗涤细胞，流式细胞仪(FACS)缓冲液加TMRE (15nm)复苏细胞。采用流式细胞术对标本进行分析。血浆细胞分离和细胞死亡分析
从骨髓活检中分离出单核细胞(包括浆细胞)，并在Ficoll梯度上纯化。将BM抽吸液(约15 mL)与预热的PBS(37℃)1:1稀释，覆盖于预热的15 mL ficol - hypaque (Amersham)上。室温下2000转/分离心20分钟后，取出单核细胞，PBS洗净，血球计计数，电镀。细胞(4×105)培养的存在与否As2O3(2μM)有或没有AA(100μM)或依托泊苷(10μg /毫升)。48小时后，用藻红蛋白偶联小鼠抗人CD38抗体(Becton Dickinson)、cychrom偶联小鼠抗人CD45抗体(Becton Dickinson)和fitc偶联Annexin V (Biovision)对细胞进行三倍染色。对照组包括未染色细胞，对照组小鼠免疫球蛋白G (IgG)染色细胞和单染色细胞。恶性浆细胞是指表达高水平CD38和无或低水平CD45 (CD38+/CD45−)的细胞。将40个非浆细胞定义为低表达或不表达CD38的细胞(CD38−)。细胞凋亡采用细胞任务软件FACScan分析。
统计分析
数据用图形表示为平均值±标准差(SD)或±平均标准误差(SE)。治疗组分别采用独立t检验或配对ttest进行比较，每个图例中均有P报告。使用Sigmaplot软件(Jandel Scientific, Chicago, IL)进行统计分析。
结果
为了确定As2O3是否具有治疗MM的潜力，我们首先研究了As2O3诱导人MM细胞系8226/S、8226/Dox40和U266凋亡的能力。8226/S细胞株是一株Il -6无关的MM细胞株，对化疗诱导的细胞凋亡敏感。阿霉素中8226/S细胞的选择产生了8226/Dox40系;该细胞株过度表达药物外排泵PgP、10和抗凋亡蛋白Bcl-xL。1439 8226/Dox40细胞在不含doxorubicin的培养基中维持着对doxorubicin的耐药，并且由于对依托泊苷具有交叉耐药(图1a)而表现出多药耐药表型。U266细胞依赖自分泌IL-6环，与8226/S细胞相比，表达高水平的Bcl-xL
图1所示。MM细胞在临床相关的浓度对As2O3敏感。(A) 8226 / Dox40和8226 / S细胞培养在没有(控制、■)或依托泊苷的存在(10μg / mL,░)或阿霉素(200 nM,▪) 48小时。可行性评估方法见“材料和方法”。数据以至少3个实验的平均值±SD表示。*治疗组均值明显低于对照组(P < .0001)。(B)细胞被孵化的存在与否表明As2O3浓度(1 - 100μM) 48小时。可行性评估方法见“材料和方法”。数据表示为5个8226/S(▪)和8226/Dox40(▪)单元的平均值±SD, 3个U266单元的平均值±SD(●)。(C)细胞治疗(▨)或没有il - 6 (■, 100 ng / mL) 1小时。文化被孵化的存在与否As2O3(2μM) 48小时。可行性评估方法见“材料和方法”。数据以每组至少3次实验的平均值±SD表示。*意味着As-treated (░), + IL-6-treated(▪)细胞明显低于控制细胞(P < .003)。
As2O3浓度升高处理细胞，48小时后用Annexin V-PI染色检测细胞活力。如图1B所示，3个细胞株对As2O3均呈剂量依赖性敏感。发布的报告显示,等离子体水平的As2O3高峰在5到7μM并在1到2μM高原。19 41因此,As2O3cytotoxicity发现1μM和10之间μM发生在治疗剂量可实现的。基于MM细胞剂量反应曲线和As2O3achievable体内的浓度,我们执行这个报告中所有后续实验2μM As2O3浓度。
IL-6是恶性浆细胞的主要生存因子。15 16例如,il - 6可以防止恶性浆细胞凋亡从不同的刺激,包括地塞米松、CD95 / Fas,血清饥饿,γ-irradiation。39 42-44确定il - 6的保护从As2O3-induced MM细胞细胞死亡,细胞被孵化的存在和缺乏白介素1小时,然后As2O3(2μM)补充道。与对照组相比，IL-6对As2O3处理的U266或8226/S细胞的存活率没有影响(图1C)。这些数据表明，IL-6不足以阻止as2o3诱导的MM细胞系细胞死亡。
由于8226/Dox40细胞表现出多种耐药机制(PgP表达和Bcl-xL水平升高)，并且Bcl-xL表达正在成为潜在的重要的预后指标，我们接下来正式确定Bcl-xL水平升高是否影响As2O3敏感性。首先，分析稳定表达外源性Bcl-xL的U266细胞(Oshiro等，投稿)对不同类型的凋亡诱导剂的耐药性，以及Annexin V和PI排除法监测的细胞死亡情况。对照组细胞存活率无差异(u266,87.2%±6.6%;U266/Bcl-xL、92.3%±6.3%)、U266/Bcl-xL细胞经依托泊苷、staurosporine、紫杉醇处理后敏感性均低于U266细胞(P < .001;图2 a)。U266 / Bcl-xL细胞治疗As2O3(2μM)和化验细胞生存能力在指定的时间(图2 b)。U266/Bcl-xL细胞最初对As2O3耐药(73.3%±4.3%);然而，Bcl-xL只能延迟As2O3诱导的死亡，因为细胞在96小时内存活率低于35%。从这些研究中，我们得出结论，As2O3可以克服或绕过IL-6信号，药物外排泵PgP，并提高Bcl-xL在MM细胞中的表达。
图2所示。Bcl-xL延迟As2O3-induced在多发性骨髓瘤细胞细胞死亡。(A) U266(■)和U266 / Bcl-xL(░)孵化的存在与否,依托泊苷(Etop修建;10μg /毫升),阿霉素(阿霉素;， staurosporine (St;0.5μM)和紫杉醇(0.5μM) 48小时。可行性评估方法见“材料和方法”。数据以每组至少4个实验的平均值±SD表示。*处理U266细胞的平均值显著低于处理U266/Bcl-xLcells的平均值(P < .01)。(B) U266 / Bcl-xL细胞在孵化(⋄)或缺失(■)As2O3(2μM)表示。可行性评估方法见“材料和方法”。数据以每个时间点至少4次实验的平均值±SD表示。
符合我们体外数据,只有大约75%的细胞死亡是一个10μM剂量的As2O3(图1 b),最近的临床研究显示适度的反应与As2O3 MM.46Therefore患者,As2O3优化MM细胞敏感性,我们接下来发起的研究,以确定在MM细胞As2O3行动的机制。在其他细胞类型中，对as2o3的敏感性与细胞内谷胱甘肽水平有关。为了确定GSH水平的升高是否影响MM细胞对As2O3的敏感性，我们测量了NAC阻断As2O3诱导的凋亡的能力。NAC是一种抗氧化剂，其功能是通过提供半胱氨酸从头合成谷胱甘肽。与谷胱甘肽在决定细胞对As2O3的敏感性方面的关键作用一致，NAC废除了As2O3介导的细胞死亡(图3)。
图3所示。
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图3所示。NAC能减弱as2o3介导的细胞死亡。细胞(2.5×105)培养没有(■)或As2O3(2μM;░)或As2O3(2μM)和南汽(10μM;▪)48小时。采用Annexin V-FITC染色，PI染色，流式细胞仪(FACScan)分析。数据以每个细胞系至少3个独立实验的平均值±SD表示。* As+ nacl处理细胞和对照细胞的均值显著低于As+ nacl处理细胞(P < .005)。**处理后细胞的均值低于As+ nacl处理后细胞(P < .03)和对照组细胞(P < .005)。与对照组相比，经As+ nacl处理的细胞平均值明显降低(P < .01)。
因此，如果GSH合成的增加能够减弱as2o3诱导的细胞死亡，那么降低MM细胞GSH水平的化合物可能会增强as2o3介导的细胞凋亡。除了其良好的抗氧化作用，36 AA已被证明具有促氧化特性。37 38 AA自氧化脱氢抗坏血酸盐可产生H2O2.38 47 48脱氢抗坏血酸盐，然后谷氨酰胺多辛以谷胱甘肽依赖的方式迅速还原为AA。将脱氢抗坏血酸还原为AA会导致细胞内GSH.38 47 48的减少，由于AA在体内耐受良好，因此AA和As2O3联合使用可能比单独使用As2O3对耐药MM更有效。因此，我们测试了AA在MM细胞系中耗尽GSH和增强As2O3细胞毒性的能力。
首先，我们确定AA处理是否会耗尽MM细胞系中的谷胱甘肽。如图4所示,孵化与AA在体内的浓度可以实现的补充维生素C(100μM) 49导致减少(超过2倍)的谷胱甘肽水平在所有4细胞系。与它提出的促氧化活性相一致，aa介导的细胞内谷胱甘肽水平下降与H2O2产量增加在功能上相关(图4B)。然而，AA单独对细胞活力没有影响(图4B)，这表明AA没有产生足够的H2O2水平来启动氧化损伤。相反，AA处理增加了细胞H2O2的基础水平。
图4所示。抗坏血酸消耗细胞内的谷胱甘肽,提高过氧化氢生产毫米细胞系。(A)(4×106)细胞培养在没有(■)或AA(100μM;░)。用谷胱甘肽试剂盒(Calbiochem)测定谷胱甘肽水平，并将其归一化为细胞总蛋白含量。数据以每个细胞系至少3个独立实验的平均值±SD表示。* aa处理细胞的平均值低于对照组细胞(P < .001)。(2.5×105)(B)细胞培养24小时没有(虚线)或AA(100μM;实线)。细胞被孵化30分钟在0.5μM H2DCFDA,清洗,通过流式细胞术。数据代表每个细胞系至少3个实验。PI排除法监测细胞存活率百分比，如图所示。
谷胱甘肽的消耗和随后AA升高的基础H2O2应该使细胞更容易受到由谷胱甘肽结合代谢的化合物的损害。此外，aa介导的谷胱甘肽降低可能损害细胞从氧化损伤中恢复的能力。为了确定AA介导的GSH降低是否足以增加MM细胞对As2O3的敏感性，MM细胞在有无AA的情况下用As2O3处理，流式细胞术测定细胞活力。培养48小时后，对8226/S、8226/Dox40、U266细胞株进行分析;治疗72小时后检测U266/Bcl-xL细胞。As2O3单独诱导每个细胞系的细胞死亡(30% - 60%)，如图5所示。然而，与单独处理As2O3相比，AA和As2O3联合使用导致4个细胞系的凋亡均显著增加(约30%)(图5)。
图5所示。
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图5所示。抗坏血酸增强as2o3介导的多发性骨髓瘤细胞系细胞死亡。细胞培养在没有(■)或As2O3(2μM;░)、AA(100μM;▨)或As2O3 + AA (▪)。在8226/S、8226/Dox40和U266细胞系48小时后，或在U266/Bcl-xL细胞系72小时后，按“材料和方法”中描述的方法评估存活率。数据以每个细胞系至少4个实验的平均值±SD表示。处理后细胞的平均值低于对照细胞和aa处理后细胞的平均值(P < .002)。** As+ aa处理细胞的平均值低于As处理细胞(P < .02)。处理后细胞的平均值低于对照细胞和aa处理后细胞的平均值(P < .01)。经As+ aa处理的细胞数低于经As处理的细胞数(P < .02)。
综上所述，NAC和AA的研究结果与GSH是决定MM细胞As2O3敏感性的关键因素的模型一致。有证据表明，谷胱甘肽可以与砷化合物结合，从而形成一种复合物，很容易被MRP2/cMOAT转运体排出。因此，GSH水平的降低可以减少As2O3的外排，从而导致细胞内As2O3的积累，增加细胞毒性。然而，由于8226/S和8226/Dox40细胞都不表达MRP2/cMOAT,51-55，因此，在MM细胞中观察到的aa介导的细胞死亡增加的基础上，不太可能存在gsh依赖的外流机制。
另外，谷胱甘肽的消耗和随之而来的基础H2O2水平的升高会使细胞对氧化损伤更加敏感。由于AA增强了As2O3介导的细胞死亡，因此As2O3处理可能增加了ROS的生成。为了直接评估As2O3对ROS产生的影响，我们使用流式细胞术测量了经过24小时As2O3处理后MM细胞株的超氧化物产生(图6)。超氧化物的产生与凋亡细胞的初始检测一致(图6)。AA单独对超氧化物的产生没有影响(P > .05)，但是AA和As2O3的结合导致超氧化物的水平高于单独的As2O3(图6;P <。0003 for 8226/S, 8226/Dox40, U266 cells;P <。用于U266/Bcl-xL单元的0005)。超氧化物主要产生于线粒体中，可导致膜磷脂自由基攻击，导致线粒体膜电位丧失。因此，我们接下来确定了线粒体膜完整性是否受到As2O3的影响，以及AA是否能够增加As2O3介导的完整性缺失。利用流式细胞术，我们测量了MM细胞线粒体在存在和不存在As2O3的情况下维持膜电位的能力。As2O3治疗导致内线粒体膜的去极化(图7)。AA本身没有对线粒体膜电位的影响,但As2O3和AA导致细胞显示线粒体膜电位下降的比例超过单独使用As2O3(图7)。这些发现与As2O3通过生成ROS发挥细胞毒性作用，导致自由基细胞损伤是一致的。
图6所示。
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图6所示。抗坏血酸增强了as2o3介导的超氧化物的生成。细胞(2.5×105)培养24小时没有或存在As2O3(2μM), AA(100μM),或As2O3 + AA,表示。细胞用氢乙胺染色，如“材料和方法”所述。数据以每个细胞系至少6次实验中氢乙啶荧光(■，左侧标尺)的平均值±SD表示。As-或As+ aa处理细胞的平均值高于aa处理细胞和对照细胞(P < .0003)。**经As+ aa处理的细胞平均值高于经As处理的细胞平均值(P < .03)。处理后细胞的平均值高于处理后细胞和对照组细胞的平均值(P < .03)。经As+ aa处理的细胞数高于经As处理的细胞数(P < .0005)。Annexin V-FITC染色检测细胞存活率百分比，用灰条(右标度)表示每个细胞系至少6次实验的平均值±SD。
图7所示。
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图7所示。抗坏血酸增强as2o3介导的线粒体膜电位的破坏。细胞(2×105)培养没有(虚线)或As2O3(2μM;实线),AA(100μM;点)，或As2O3+AA(加粗)48小时。线粒体膜电位通过TMRE荧光和FACScan分析测定，详见《材料与方法》。采用Annexin V-FITC检测细胞活力(inset)， PI染色后进行流式细胞仪(FACScan)分析。每个细胞系有三个独立的实验数据。
基于我们发现As2O3和AA诱导细胞凋亡在非耐药MM细胞系,我们扩大了我们的研究的细胞毒性测试As2O3 As2O3的组合和AA患者样本毫米。首先,确定AA可以消耗在新鲜分离细胞中谷胱甘肽,单核细胞(包括浆细胞)隔绝BM吸入物从2患者存在与否的孵化临床可行的浓度AA(100μM) 48小时。细胞内谷胱甘肽水平的测量方法见“材料和方法”。“由于从BM抽吸物中分离出的细胞总数很少，在GSH测量之前，不可能从非浆细胞(CD38+/CD45−)中对浆细胞(CD38+/CD45−)进行分类。然而，这些BM吸入物平均含有40%的浆细胞。AA处理48小时后，总细胞GSH水平下降20多倍(图8)。
图8所示。
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图8所示。抗坏血酸消耗多发性骨髓瘤患者单核细胞内的谷胱甘肽。如“材料和方法”所述，从BM吸入物中分离出单核细胞。“细胞(4×106)没有孵化(■)或AA(100μM;▪)48小时。GSH水平按“材料和方法”中描述的方法测定，并以2例患者样本的平均值表示。* aa处理细胞的平均值低于对照组细胞(P < .005)。
此外，对经新诊断的(n = 9)和化学分形(n = 14) MM患者同意分离的单核细胞进行生存能力研究。细胞在有无as2o3、有无AA或依托泊苷的情况下培养48小时，用抗cd38、抗cd45抗体及Annexin V染色，流式细胞术检测三染色细胞的存活情况。在这些研究中包括依托泊苷有两个原因。首先，它允许与对药物外排泵敏感的凋亡诱导剂进行比较。其次，由于化疗可分型MM患者没有接受相同的治疗方案，我们希望使用一种没有患者接受过治疗的药物来消除任何可能干扰我们分析的特定耐药性。这些研究表明，As2O3选择性地诱导新生和难治性MM患者血浆细胞群(CD38+CD45−)的凋亡(图9A-B)。与MM细胞系的研究一致，AA足以增强难治性MM患者吸入的BM中恶性浆细胞As2O3的细胞毒性(图9b;P < 04)。有趣的是，在新生患者样本中，AA和As2O3联合使用的结果与单独使用As2O3的结果没有显著差异(图9A;P > .05)。然而，新诊断MM患者的浆细胞对As2O3的敏感性(30.23%±5.42%)高于难治性MM患者(25.12%±4.83%)。相比之下，As2O3 + AA诱导的细胞死亡在新生和化学分裂患者样本中几乎相同(39.40%±3.58% vs 38.46%±6.34%)。因此，As2O3和As2O3+AA处理组之间缺乏显著差异，这似乎是因为新生细胞对单独的As2O3更敏感。可能是谷胱甘肽水平的差异造成了这种明显的敏感性差异。非血浆、CD38−细胞经As、AA + As或依托泊苷处理后的存活率在新生和难处理样品中均无显著差异(图9A-B;(P > . 05)。AA单独治疗在任何细胞群中都没有细胞毒性，这表明AA有潜力成为一种安全有效的as2o3为基础的化疗增敏剂。
图9所示。
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图9所示。浆细胞As2O3多发性骨髓瘤患者的敏感和抗坏血酸。(A) BM单核细胞分离新诊断患者毫米(n = 9)和培养在没有或存在As2O3(2μM;░)、AA(100μM;▨),As2O3 + AA(▪),或依托泊苷(10μg /毫升;■)48小时，如“材料和方法”所述。然后用藻红蛋白偶联的抗CD38、环磷酰胺偶联的抗CD45和fitc偶联的Annexin v对细胞进行三倍染色。用FACScan分析确定CD38/CD45−细胞(骨髓瘤细胞)和CD38−细胞(非骨髓瘤细胞)的死亡情况。数据用处理过的细胞凋亡百分比(Annexin V-FITC +)减去未处理过的细胞凋亡百分比的平均值±SE表示。采用配对t检验进行统计分析，其中AA+在CD38/CD45−中与AA和依托泊苷不同(**P < .0006)，而AA在CD38−中与AA不同(*P < .03)。(B) BM单核细胞被隔绝耐火MM (n = 14),患者治疗,并分析了所述面板a使用配对t检验进行统计分析,AA +,不同于,AA,依托泊苷CD38 / CD45−人口(* * P < .02点)和AA + CD38的不同于AA−人口(* P < . 03)。
讨论
MM细胞最终获得一种耐药表型，包括药物外排泵的表达、凋亡阈值的变化以及化疗药物解毒或代谢能力的增强。难治性MM的有效治疗必须能够克服或绕过这些适应性细胞变化。本研究表明，As2O3对MM内药物外排泵耐药机制不敏感，pgp阳性细胞株8226/Dox40在体外对As2O3发生凋亡反应，与药敏细胞株8226/S相似(图1B)。IL-6不能减弱As2O3诱导的细胞死亡(图1C)。同样，抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达增加并不会对As2O3产生耐药性，因为表达外源性Bcl-xL的MM细胞对As2O3敏感(图2B)。这些数据与最近的研究一致，表明As2O3诱导过表达Bcl-2或Bcl-xL的白血病细胞系凋亡。其他研究表明，As2O3通过下调基因表达抑制Bcl-2;然而，我们没有检测到as2o3治疗后Bcl-xL表达的任何变化(J.M.G.),N.J.B.,L.H.B.，《未发表的观察》(unpublished observation, 2000年3月)。此外，As2O3治疗诱导了重复多次VAD和melphalan-prednisone治疗失败患者的浆细胞凋亡(图9B)。这些数据表明，As2O3可能克服药物外排机制和IL-6和Bcl-xL在化学分形MM中的抗凋亡作用。我们的数据表明，ROS的产生是As2O3诱导的MM细胞死亡的关键因素。首先，As2O3介导的细胞死亡在NAC存在的情况下被消除(图3)。值得注意的是，As2O3已被报道与邻近的硫醇基团结合，而NAC包含2个这样的硫醇基团。然而,NAC的保护作用可能是由于增加的谷胱甘肽水平,而不是NAC淬灭了 As2O3，因为二硫苏糖醇的加入,在浓度5倍,在这些研究中使用的NAC(50μM二硫苏糖醇与10μM NAC),只能部分防止As2O3-诱导的 MM细胞中细胞死亡(J.M.G.,N.J.B.,L.H.B.，发表于1999年11月)。支持氧化途径在As2O3介导的细胞死亡中发挥作用的其他证据来自AA、谷胱甘肽和As2O3细胞毒性之间的关系。AA已被证明可降低GSH水平，并增强As2O3介导的淋巴细胞和髓细胞死亡.
众所周知，谷胱甘肽氧化还原系统会影响砷化合物的活性。首先，在其他模型系统中，As2O3敏感性与细胞内谷胱甘肽水平相关。表达高水平GSH23 27或gsh相关酶的细胞对As2O3的敏感性低于表达低水平这些分子的细胞。此外，谷胱甘肽水平升高的细胞可以通过消耗细胞内谷胱甘肽的药物，如丁硫氨酸、磺酰亚胺或乙基丙烯酸，对As2O3敏化。谷胱甘肽通过多种机制发挥抗氧化作用。它可以结合，从而使产生自由基的分子失活。在无细胞体系中，三价砷可与谷胱甘肽络合，形成短暂的As(GS)3分子。此外，GSH结合可以使分子更容易通过药物外排泵排出。Kala等人最近证明，亚砷酸钠的胆汁排泄需要GSH和MRP2/cMOAT转运蛋白。然而，由于MRP2/cMOAT在骨髓瘤细胞中未检测到表达，包括8226/S和8226/ dox40,并且由于原始MM样品表达的MRP水平与正常浆细胞相当，因此该机制在MM细胞中不太可能相关。值得注意的是，尽管我们的研究表明，在MM细胞中，As2O3或其代谢物不太可能发生GSH依赖的外排，但GSH结合参与调节As2O3敏感性的可能性仍然存在。谷胱甘肽也会被氧化，并为谷胱甘肽过氧化物酶等酶提供电子，使H2O2还原为H2O。显然，通过GSH过氧化物酶直接偶联As2O3和抑制As2O3诱导的ROS生成并不是相互排斥的机制，因为两者都可以促进As2O3解毒。GSH抑制As2O3诱导的MM细胞死亡的相关作用模式仍有待确定。
AA是否具有正面或抗氧化作用的确切决定因素尚不清楚，但它们似乎是暂时的。用AA(50μM)和RGS共同处理AS52细胞，比单独使用RGS处理AS52细胞，导致细胞死亡增加。然而，当AS52细胞用AA预处理24小时，然后用RGS处理后，细胞受到保护。因此，AA治疗的时机可能会影响AA是否具有增强或抑制氧化损伤细胞毒性的作用.
从我们研究MM细胞系的数据让我们假定As2O3和AA的结合可能是一个可行的治疗难治性患者和高原MM的可行性治疗。开始解决这一假说,我们扩大了我们的体外研究包括研究利用新诊断患者的血浆细胞和难治性MM。类似与MM细胞系测定的数据,AA治疗降低了MM患者骨髓单核细胞中谷胱甘肽的水平。新分离的MM浆细胞对As2O3敏感，AA增强了难治性患者样本的细胞毒性;非浆细胞群体相对不受影响(图9A-B)。MM培养物中含有混合的单核细胞群，包括BM基质细胞(BMSCs)， MM患者培养物中BMSCs的存在可能影响了As2O3的治疗效果。据报道，与骨髓间充质干细胞的相互作用可以对某些抗肿瘤药物提供细胞保护，并提供关键的有丝分裂和抗凋亡生长因子和细胞因子。此外，细胞黏附介导的耐药正在成为一种潜在的BM基质细胞(BMSCs)相关机制，通过这种机制，恶性细胞可以逃避凋亡信号，并允许发展更经典的耐药表型(射流泵等)。综上所述,我们的数据与MM细胞系和MM患者样本表明As2O3和AA的结合是一个强有力的候选人作为治疗MM。为了确定联合治疗难治性和高原MM患者的安全性和有效性，美国国家癌症研究所(National Cancer institute)赞助的I/II期临床试验已在迈阿密大学(University of Miami)展开。
由于大多数MM患者最终会发展到难治性状态并死于癌症，因此确定能够克服或绕过化疗耐药性的新疗法至关重要。As2O3是一种治疗难治性急性早幼粒细胞白血病的有效药物。值得注意的是，As2O3治疗难治性急性早幼粒细胞白血病的安全性和有效性已得到证实。本报告中使用的AA和As2O3浓度完全在临床可达到的血清水平内，且据报道独立耐受性良好。综上所述，As2O3是抗肿瘤药物库中令人兴奋的新成员，作为MM的治疗药物值得认真研究。As2O3介导的细胞死亡机制似乎是多因素和细胞特异性的。我们的研究支持GSH和ROS的产生作为As2O3诱导的MM细胞死亡的关键介质的作用。在As2O3和其他GSH敏感的药物中添加AA可以优化特异性化疗药物的细胞毒性，且毒性很小。
Ascorbic acid enhances arsenic trioxide–induced cytotoxicity in multiple myeloma cells | Blood Journal http://www.bloodjournal.org/content/98/3/805?sso-checked=true