用于癌症治疗的细胞内pH值脆弱性的系统分析-癌细胞有反向的pH梯度：内碱外酸

Systems analysis of intracellular pH vulnerabilities for cancer therapy


摘要

反向pH梯度是癌症代谢的一个标志，表现为细胞外酸中毒和细胞内碱化。虽然细胞外酸中毒的后果是已知的，但细胞内碱化的作用尚不完全了解。通过重建和整合酶依赖于pH的活性谱到细胞特异性基因组级代谢模型中，我们开发了一种计算方法，探索细胞内pH (pHi)如何调节代谢。我们发现，在silico，碱性pHi能使癌细胞增殖最大化，同时还能促进糖酵解和对缺氧的适应。而酸性pHi(细胞内pH值）抑制了这些适应性，影响了肿瘤细胞的生长。然后，我们系统地确定代谢靶点(GAPDH和GPI)，预测其在酸性pHi的放大抗癌作用，形成一种新的治疗策略。在乳腺癌细胞中对这种策略的实验测试表明，它对侵袭性表型尤其有效。因此，本研究提出pHi在癌症代谢中的重要作用，并为探索pHi在其他生物医学领域中的作用提供了一个概念和计算框架。

介绍

大多数癌细胞表现出符合Warburg效应1,2,3的代谢适应性，包括葡萄糖和营养物质的摄取增加和乳酸的产生，甚至在有氧条件下，以及对低氧和低营养微环境的适应。细胞外环境的酸化(低pHe)和细胞内细胞质碱化(高pHi)是癌症的其他特征，导致癌细胞(pHi > 7.2, pHe ~ 6.7-7.1)相对于正常细胞(pHi ~ 7.2, pHe ~ 7.4)的pH梯度发生逆转。这种反向的pH梯度依赖于控制pH稳态的各种质膜转运蛋白和酸性外排蛋白的表达和/或活性的增加，包括单羧酸转运蛋白(MCTs)、Na+ -H +交换蛋白(NHEs)和碳酸酐酶(CAs)。虽然局部差异很大，但肿瘤中平均pHe和氧分压(pO2)均与肿瘤离最近血管的距离高度相关8。这引起了促进细胞内碱化的各种转运体活性的变化，pH梯度的逆转与氧的利用率之间总体上存在显著的相关性，但也存在非线性关系。

值得注意的是，反向pH梯度与肿瘤增殖、侵袭、转移、侵袭性和治疗耐受性5、6、11、12、13、14有关。从力学上看,这些表型归因于细胞外酸中毒的影响在几个流程,包括诱导生长因子(例如,通过HIF1αVEGF),使用分泌乳酸作为营养来源15,抑制免疫监视6, 17,18和进化选择耐酸恶性细胞的肿瘤微环境19, 20,21。通过抑制膜转运体来破坏pH控制已经被认为是一种治疗策略22,23，事实上一些膜转运抑制剂目前正在临床试验中。此外，有研究表明，抑制这些转运体可诱导细胞内的毒性酸中毒，而细胞内的碱性环境是癌细胞存活所必需的。然而，目前还不清楚pHi与癌细胞生长和代谢的关系，以及破坏pHi的控制是否可以用于治疗。

鉴于omics驱动的个性化代谢模型27,28和酶动力学的强大生化数据的出现，我们试图填补计算上的空白，并开发了一种严格的方法来推断代谢酶的ph依赖的活性谱，然后将它们整合到癌症和正常细胞的基因组级代谢模型(GSMMs)中。这种在硅系统中的方法使我们能够评估干扰pHi对细胞内代谢状态的影响，并提出和实验验证一种临床相关的新治疗策略来选择性地靶向癌症。

　

概念的实验证明
为了验证针对癌细胞碱性pHi偏好的治疗策略，我们设计了实验，首先通过阻断乳酸转运体来降低pHi，然后抑制主要的选择性和ph特异性靶点GAPDH和GPI(图3、方法和补充图13-16)。该策略在三个乳腺细胞系中进行了测试，以控制微环境中的氧利用率和pHe水平:(i) MCF10A正常乳腺上皮细胞;(ii)初生和耐酸(AA) MCF7雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌细胞;(iii)幼稚型和AA三阴性MDA-MB-231乳腺癌细胞。这些特定的AA表型具有特殊的临床意义，因为这些肿瘤细胞在酸性和低氧微环境中具有侵袭性，缺乏有效的治疗方法。利用ph敏感分子荧光探针sctf -1琥珀酰亚胺酯的发射光谱，在单细胞水平通过共聚焦显微镜测定细胞pHi(补充图13)。

为了操纵pHi，我们测试了MCTs 1和2 (MCT1/2)35的选择性小分子抑制剂在四种不同条件下的效果，这些条件分别代表了肿瘤微环境的细胞外状态、生理pHe、低pHe、常氧和缺氧(图3a)。在常氧和生理pHe条件下，MCF7乳腺癌细胞的pHi处于生理水平，抑制MCT1/2仅使pHi略有降低。然而，急性缺氧会显著降低pHi值，在缺氧的情况下，pHi值会转化为糖酵解作为唯一的能量来源，产生大量的质子作为副产品，这可能会给细胞带来巨大的压力。相反，慢性缺氧不会导致酸性pHi水平;据推测，由于某些适应作用，对细胞施加的压力较小，在这些条件下，抑制MCT1/2可显著降低pHi值。在AA MCF7癌细胞中，慢性缺氧加上MCT1/2抑制使pHi降低了0.3个pH单位以上。这些影响与pHe水平呈弱相关(补充图13)。

为了验证预测的选择性和ph特异性目标GAPDH和GPI的抗增殖作用，我们使用siRNAs敲除每个基因(图3b)，并在四种微环境条件下评估它们对细胞增殖(图3c)和生存(图3d)的影响。与模型预测一致，通过缺氧和MCT1/2抑制降低pHi降低了幼稚型和AA型MCF7细胞的增殖，而GAPDH和GPI的下调进一步降低了细胞的增殖，这在酸性pHi上表现得最为明显(图3c)。GAPDH的抑制作用比GPI更大，这与敲除效率有关(图3b)。

为了测试对细胞增殖的影响是否转化为对癌细胞的有效杀伤，我们使用生存能力测定(方法)评估了细胞的存活率。值得注意的是，通过缺氧和MCT1/2抑制降低pHi降低了MCF7乳腺癌细胞的存活率(图3d)。在常氧条件下，pHi水平保持在生理水平，细胞存活受MCT1/2抑制作用较弱，pHe较低时AA细胞除外。此外，在缺氧和MCT1/2抑制引起的酸性pHi条件下，GAPDH的进一步下调，以及GPI较小程度的下调，会触发细胞死亡，尤其是在更具侵袭性的AA MCF7乳腺癌细胞中(图3d)。细胞外酸中毒对癌细胞的存活影响较弱，从pHe与pHi之间的弱耦合可以看出(补充图13)。此外，与模型一致，该策略对癌细胞是选择性的，因为缺氧、MCT1/2抑制和GAPDH或GPI的下调对正常MCF10A乳腺上皮细胞的存活只有非常微弱的影响(补充图14)。然而，该策略未能杀死三阴性的MDA-MB-231乳腺癌细胞，在这些细胞中，pHi值无法达到足够低的水平(补充图15)，这可能是由于MCT4转运蛋白表达升高所致，该转运蛋白对选择性MCT1/2抑制剂的作用具有耐药性。

为了了解naive和AA MCF7乳腺癌细胞之间的差异，我们测量了不同乳酸转运体的表达(补充图16)。在所有条件下，单纯细胞表达MCT2，只有AA细胞表达MCT4, MCT1表达较少。此外，AA细胞的代谢状态比原始细胞的发酵性更低，氧化性更强，其ECAR较低，OCR率较高(补充图16)。因此这些战略的成功应用AA电池可能是因为获得的最低φ(~ 6.9),也可能是由于他们的适应和碱性φ的依赖,使他们更容易受到这些干扰,尽管额外的转运蛋白的活动及其转向氧化代谢。

缺氧可能施加压力对细胞和引起广泛影响,很难控制和测量,额外的实验进行了评估结果的鲁棒性天真和AA MCF7细胞(图4)。在这些实验φnormoxia降低了抑制Na + - h +的功能换热器NHE1通过cariporide治疗。这种策略在低pHe时最为成功(图4a)。然后，我们抑制了顶部目标(GAPDH和GPI)，以及从不同代谢途径(RPIA、ACAT2和PFAS)识别的另外三个目标。通过qRT-PCR和western blot分析验证了sirna定向敲除这些靶点的有效性(图4b)。同样，在这些实验中，这些靶点的下调降低了低pHi值时MCF7癌细胞的存活率，同样，这在低pHe时更为显著，此时达到了最低pHi值(图4c)。在不同的条件和细胞中，预测的选择性和ph特异性目标GAPDH、GPI和ACAT2对癌细胞存活的危害最大。相对于对照组，AA细胞中这一现象更为明显，尽管这些细胞中pHi值的降低幅度较小，这表明这些靶点在这些细胞中表现出的攻击性表型中发挥着重要作用。相比之下，预测的选择性和ph特异性靶RPIA在细胞间表现出不一致的作用，可能是因为它需要pHi更大的降低来诱导AA细胞的抗增殖作用。作为一个重要的对照，预测的选择性但非ph特异性靶PFAS的下调相对于低pHi水平的对照细胞没有增强抗增殖作用，而PFAS是对ph最不敏感的代谢靶点。最后，我们还测试了代谢扰动对正常MCF10A乳腺上皮细胞的影响，其中NHE1抑制仅轻度影响pHi和细胞的生存能力(补充图17)。

　

为了了解原始细胞和AA MCF7乳腺癌细胞之间的差异，我们测量了不同乳酸转运体的表达(补充图16)。在所有条件下，单纯细胞表达MCT2，只有AA细胞表达MCT4, MCT1表达较少。此外，AA细胞的代谢状态比原始细胞的发酵性更低，氧化性更强，其ECAR较低，OCR率较高(补充图16)。因此这些战略的成功应用AA电池可能是因为获得的最低φ(~ 6.9),也可能是由于他们的适应和碱性φ的依赖,使他们更容易受到这些干扰,尽管额外的转运蛋白的活动及其转向氧化代谢。

缺氧可能施加压力对细胞和引起广泛影响,很难控制和测量,额外的实验进行评估原始细胞和AA MCF7细胞活性的结果(图4)。在这些实验，通过使用cariporide抑制钠-氢交换体（Na-H exchanger),降低了pHi.这种策略在低pHe时最为成功(图4a)。然后，我们抑制了顶部目标(GAPDH和GPI)，以及从不同代谢途径(RPIA、ACAT2和PFAS)识别的另外三个目标。通过qRT-PCR和western blot分析验证了sirna定向敲除这些靶点的有效性(图4b)。同样，在这些实验中，这些靶点的下调降低了低pHi值时MCF7癌细胞的存活率，同样，这在低pHe时更为显著，此时达到了最低pHi值(图4c)。在不同的条件和细胞中，预测的选择性和pH特异性目标GAPDH、GPI和ACAT2对癌细胞存活的危害最大。相对于对照组，AA细胞中这一现象更为明显，尽管这些细胞中pHi值的降低幅度较小，这表明这些靶点在这些细胞中表现出的攻击性表型中发挥着重要作用。相比之下，预测的选择性和pH特异性靶RPIA在细胞间表现出不一致的作用，可能是因为它需要pHi更大的降低来诱导AA细胞的抗增殖作用。作为一个重要的对照，预测的选择性但非pH特异性靶PFAS的下调相对于低pHi水平的对照细胞没有增强抗增殖作用，而PFAS是对pH最不敏感的代谢靶点。最后，我们还测试了代谢扰动对正常MCF10A乳腺上皮细胞的影响，其中NHE1抑制仅轻度影响pHi和细胞的生存能力(补充图17)。

为验证抗anti-Warburg降低pHi和抑制选择pHi依赖性目标,我们进行了海马XF化验,并测量了anti-Warburg效应比率(OCR / ECAR)在乳腺癌MCF7细胞(图5)。这些测量进行正常法由于技术困难海马执行在低检化验。单独降低pHi值对癌细胞具有anti-Warburg作用，这与我们的计算结果一致(cf.，图2b)。此外，每一个依赖于pHi的靶点的下调，都在生理pHi处放大了对癌细胞的anti-Warburg效应，而在低pHi处，随着NHE1的抑制，这种放大更为显著，这也与我们的模型一致(cf.，图2d)。这些在低pHi值下增强的anti-Warburg效应在正常MCF10A细胞中没有观察到，这些细胞总体上具有更高的OCR/ECAR比值(补充图17)。

图5
figure5
降低pHi值和抑制依赖于pHi的代谢靶点的anti-Warburg作用。海马通量实验是在常氧条件下对MCF7幼稚细胞(低pHi值，黄色网格)和无(生理pHi值)抑制NHE1及所示代谢靶点的条件下进行的。pHi值(黑条)的降低对癌细胞的代谢具有抗warburg作用，这可以通过氧耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)的比值来衡量。无论是在生理pHi值还是在低pHi值，对选定目标(颜色)的额外抑制都会增强对癌细胞的anti-Warburg效应。最高的OCR/ECAR比值是在低pHi值(黄色网格)下获得的。海马实验每次在6个复制体中进行，实验重复3次。条形图表示均值，误差条形图表示均值的标准差
全尺寸图像
尽管如此，尽管该模型预测的放大效应相对于对照细胞只针对少数几个目标，但实验表明，在所有条件下，所有被检测的目标都表现出放大的抗华宝效应。因此，细胞内酸中毒具有比模型预测的更强的anti-warburg作用。这种差异可能是由于模型和实验之间的一些差异造成的。

　

讨论
总的来说，我们的研究结果表明，癌细胞在碱性pHi环境下具有更强的适应性，它们对碱性细胞内环境的依赖提供了可用于治疗的弱点。与之前的研究9,26一致，我们的发现清楚地表明降低pHi值是癌症细胞的一种选择性易损性。此外,这里我们有建立,新的计算技术的发展,可以利用这个漏洞系统地识别代谢目标攻击癌细胞在酸性pHi,形成针对转运蛋白的合成致命的治疗策略包括降低pHi结合禁用所选代谢目标。在乳腺癌细胞系中对这一策略的实验测试表明，它对已适应缺氧和细胞外酸中毒的癌细胞以及表现出侵袭性表型的癌细胞尤其有效。尽管如此，还需要进一步的研究来确定所提出的治疗肿瘤细胞的策略的临床适用性，其中降低pHi值可能需要针对几个质子泵和酸转运体，如三阴性乳腺癌细胞s35,36。

除了增殖，我们的系统分析还表明细胞内碱化和Warburg效应之间存在耦合，这种耦合表现为高pHi值下葡萄糖消耗增加和氧吸收率降低。因此，这些分析预测降低pHi值将在一定程度上逆转这些适应性。此外，在已确定的目标群体中，这些分析预测，当酸性pHi抑制GAPDH或GPI时，使其失效会增强酸性pHi的抗-warburg效应，随后进行了实验测试。有趣的是，在这项研究的同时，GAPDH最近被确定为一个抗-Warbugr目标，使用其他计算和实验技术37，这独立验证了整合计算分析和实验研究的力量在这里报道。尽管如此，GAPDH(和GPI)不仅仅是一种代谢调节剂，在癌症中具有丰富的功能，这表明其潜在治疗作用的确切机制仍有待解决。我们的结果表明，一旦开发出更有效和选择性的抑制剂，GPI的下调可能有类似的效果，如果不是更好的话。我们分析中发现的其他靶点，特别是来自戊糖磷酸途径的PGD和G6PD，也被预测对癌症具有抗增殖和抗-Warburg效应。因此，除了它们已知的抗癌作用，我们的发现表明肿瘤对PGD和G6PD抑制剂的治疗反应将在酸性pHi增强。

尽管我们的计算分析能够预测pHi对细胞代谢状态的强大影响，但仍有一些需要注意和限制的地方，以改进和扩展该方法。首先，由于生物质生产被用作优化GSMM(方法)的一个目标细胞功能，目前的分析只反映了所有可能目标的一小部分，在这些目标中，额外目标功能的制定应该导致特定的力学见解，以及可能对抗特定表型的目标。其次，要更全面地理解在扰动之后指导代谢适应的机制(即在特定的细胞类型中，模型应该通过整合细胞特异性和环境特异性的“组学”数据来细化。第三，通量平衡分析(FBA)假设代谢处于稳定状态，即代谢物浓度在时间上是恒定的。然而，已知滴定代谢物会影响某些酶的ph依赖行为，增加了预测和整合这些ph活性谱的复杂性。因此，该方法的改进应该包括更明确地考虑代谢物浓度，以及变构和协同作用的影响，这需要结构生物学的考虑。第四，我们的知识驱动的、基于同源性的管道可能会通过区分具有非常不同pH-activity profile的酶亚型45得到改善，并通过预测只有一半和没有活性的临界点来进一步细化，在这些临界点上可用的实验数据更少(补充图1)。

我们的分析为癌症的进化提供了一个新的视角。离子梯度代表了一种古老的化学渗透能产生形式，可以在热液喷口中观察到，也可以在从LUCA47到细菌等多种生命形式中观察到。这种梯度被认为是与呼吸氧化反应有关的一种原始机制，它们使细胞能够应付各种环境极端情况。因此，我们的发现，表明细胞内碱化与Warburg效应是耦合的，也可能反映了癌症普遍接受原始的单细胞增殖策略2。

重要的是，本文提出的计算方法远远超出了癌症的范畴。特别是，pH调节在免疫和细菌抗生素耐药性中起着至关重要的作用，并影响着单细胞群落的种群多样性和功能，以及神经细胞和大脑的功能。因此，本研究也提供了一个计算和概念框架，以探索pH调节的后果，以及它的治疗潜力，跨越广泛的生物医学领域。

　

参考文献：

Systems analysis of intracellular pH vulnerabilities for cancer therapy | Nature Communications https://www.nature.com/articles/s41467-018-05261-x%20%E7%94%A8